普通免疫学62013单克隆抗体（参考）.ppt

化学发光(chemiluminescent) 原理 发光液A和B分别是Luminol 和过氧化氢，在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作用下,Luminol与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体,当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。在发光过程中不需要消耗HRP,HRP只是起催化作用，所以只要HRP没降解失活,是可以重复加发光液的。但HRP作为一种蛋白酶,在室温放置时间过长,是会降解的；同时在发光过程中有什么物质(比如显影液)污染了膜的话,也有可能灭活膜上的HRP。 Lumigen PS3:化学发光检测中与辣根过氧化物酶结合的底物 , produces a more intense light emission of linger duration 样品1 样品2 电泳迁移率：在特定介质中单位电场强度的带电颗粒电泳移动速度。电泳迁移率与颗粒所带电荷量成正比，与颗粒的半径和介质黏度成反比。实际工作中常用相对电泳迁移率，即两种带电颗粒在同一介质、同一电场中泳动距离之比。 一般情况下电泳中蛋白质分子量对数与迁移率呈线性关系 。 问题 单克隆抗体是如何制备的？ 什么是免疫共沉淀？ Western杂交试验？ (荧光醇) (过氧酸 ,-O-O-) 放射免疫分析： 免疫荧光分析: 将荧光化合物标记抗体。需要激发，才能发出荧光。 IRDye near infrared fluorescent dyes are setting new standards for protein and cellular assays, microscopy, and in vivo molecular imaging. These dyes have excellent water solubility, near infrared (700-800 nm) emission wavelengths where autofluorescence is low, and minimal non-specific binding. Use IRDye infrared dyes for labeling nucleic acids, antibodies, proteins, peptides, viruses, cytokines and chemokines whenever you need bright signal, low background imaging. Li-COR ChiP-to-Chip（染色质免疫沉淀分析和芯片） 染色质免疫沉淀分析Chromatin Immunoprecipitation Assay, ChiP 胶电泳迁移率改变分析（EMSA）是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，但是由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。 染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。 DNA binding is reflected in changes in Cy-5/Cy-3 ratios. Excitation and emission spectra of unconjugated Cy3 dye in phosphate buffered saline. Properties Excitation maximum (nm) 548 Emission maximum (nm) 562 Extinction coefficient (M-1 cm-1) 150 000 * Quantum yield 0.04 * Fluorescence lifetime (ns) 0.3 Excitation and emission spectra of unconjugated Cy5 dye in phosphate buffered saline. Properties Excitation maximum (nm) 646 Emission maximum (nm) 664 Extinction coefficient (M-1 cm-1) 250 000 * Quantum yield 0.27 * Fluorescence lifetime (ns) 1.0 抗体稀释度应根据： ①抗体效价高，溶液中特异性抗体浓度越高，工作稀释度越高；②一般讲，应用的抗体稀释度越大，温育时