分子生物学实验指南.doc

分 子 生 物 学 实 验 指 南 生物工程与生物技术教研室 2010年11月 目 录 实验一、DNA的提取及检测..…………………..…………...…………..3 实验二、PCR扩增目的基因及检测………………………………………6 实验三、目的基因片段的回收、连接………………………………….....8 实验四、大肠杆菌DH5(感受态细胞的制备………………….…………10 实验五、连接产物的转化、筛选及PCR检测………………………….....13 实验六、质粒DNA的抽提、酶切（生工专业选作）…………………........15 实验七、RNA的抽提与检测（生科专业选作）………………………......18 实验一 DNA的提取及检测一、实验目的与原理简介： 抽提的DNA可用于PCR、Southern blotting、DNA文库构建等操作。 细胞中DNA主要存在于细胞核内，称核DNA或染色体DNA，细胞质中含有少量的DNA。细胞内的各种DNA总称为总DNA。核DNA分子呈极不对称的线状结构，一条染色体为一个DNA分子。高等植物的核DNA约为109bp，如此细长的分子对任何机械力的作用都十分敏感。在DNA提取过程中，DNA分子的降解很难避免，因此提取得到的只是DNA分子的片段。植物DNA的提取常用的有以下两种方法： SDS（十二烷基硫酸钠）法：高浓度的SDS在较高温度下（55-65度）裂解细胞，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来，通过酚和氯仿抽提去除蛋白质、脂质、多糖等，通过RNaseA 消化去除RNA，最后用乙醇沉淀DNA。该法操作简便，能满足大多数实验需要。 CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法：CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，该复合物在高盐浓度（0.7mol/L NaCl）中是可溶的，通过离心就可将复合物同变性的蛋白质、多酚、多糖杂质（沉淀项）去除，水相中含有核酸与CTAB的复合物及其它可溶性的杂质，直接向水相中加入预冷的异丙醇则导致核酸的沉淀，CTAB和其它多数杂质留于异丙醇与水的混合相中，分离DNA沉淀并经75％乙醇漂洗后溶于TE （或纯水）得到DNA的粗提物。 用于精细PCR、Southern杂交和DNA文库构建的DNA则应进一步纯化。用RNase水解RNA，用酚：氯仿：异戊醇和氯仿：异戊醇抽提去蛋白杂质等，经乙醇沉淀后可获得较为纯净的植物总DNA。 二、实验准备： CTAB抽提液： 2%（w/v）CTAB 100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0) 20 mmol/L EDTA(pH8.0) 1.4 mol/L NaCl 注：抽提含多酚较多的植物材料时，上述抽提液中可另加入2%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）； 抽提液于室温保存，可在几年内保持稳定。临用之前向装有上述抽提液的试管中加入约2%-3%（v/v）的β-巯基乙醇。 醋酸钠： 3 mol/L NaAc 用冰乙酸调pH值至4.8-5.2。 TE溶液： 100mmol/L Tris-HCl 1.00 mmol/L EDTA 调pH值至8.0 。 为防止Dnase的降解作用，提取使用的各种器具及溶液均应经过高压灭菌。 三、操作步骤(CTAB 法): DNA的粗提 向10ml离心管中预先加入mlCTAB抽提液及相应量的β-巯基乙醇，65℃预热； 注：巯基乙醇可以打断多酚氧化酶的二硫键，保护酚类物质不被氧化，从而保护核酸不被降解。EDTA可以螯合二价离子，而后者是DNA酶的活性所必需的，从而抑制DNA酶的活性。 取约1g的植物材料用液氮磨成粉末，迅速用药勺转入该10ml离心管中，迅速混匀； 于65℃水浴45min，中途间隔（轻柔）混匀三次； 冷至室温后加入等体积(5ml)氯仿：异戊醇（24：1），轻柔颠倒混匀使乳化10min； 10000转／分离心10min（18-20℃）； 吸取上清（约4至5ml）于另一干净的10ml离心管中； 注：根据需要可用氯仿：异戊醇如上法重复抽提一次；吸取上清时一定不要打破沉淀层 吸取上清加入与上清液等体积（约4至5ml）且已于-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟至白色絮状沉淀出现； 注：若没有沉淀出现，则加入上清液1/5至1/10体积的pH4.8-5.2的3M NaAc混匀，于－20℃冰箱中沉淀30min； 用玻璃钩子挑出DNA（或用被剪去尖端的1.5mlTip头吸住DNA沉淀团），放入盛有1ml 75%乙醇的1.5ml Eppendorf管中； 注：若无法直接挑取时用离心法沉淀DNA 用75%乙醇中漂洗DNA沉淀，用Tip头吸干乙醇； 用1ml 75%乙醇再漂