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第四章 植物遗传转化技术 植物遗传转化是指以植物器官、组织、细胞或原生质体作为受体，通过某种技术或途径转入外源基因，获得使外源基因稳定表达的可育植株的过程。 植物遗传转化方法 花粉管导入法的特点是直接、简便。 受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍，特别适合于难以建立有效再生系统的植物。 由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞，导入的DNA分子整合效率较高。 植物遗传转化载体 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同分： 章鱼碱型（octopine） 胭脂碱型（nopaline） 农杆碱型（agropine） 琥珀碱型（agrocinoine） Ti质粒结构 T-DNA（Transfer DNA） 是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到植物细胞的一段DNA； T-DNA两端个有一段25bp的同向重复序列，是T-DNA的边缘区。 LB；RB 在同一条单链的LB和RB内各形成一个缺口，单链T-DNA进入植物细胞 存在缺陷 Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb，在基因工程中难以操作； 很难找到单一的酶切位点； 生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物； Ti质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，不能在大肠杆菌中复制。 Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。 Ti质粒的改造-去除致瘤基因Onc 由于影响植株再生的直接原因是T-DNA中的Onc基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成为无毒的质粒，即“卸甲”、“解除”、“缴械”其“武装”的Ti载体，记为Onc-，构建的Onc-载体叫“卸甲载体”。 卸甲载体：构建无毒的Ti质粒载体 例：pGV3850:是从胭脂碱Ti质粒PTIC58衍生而来的 中间表达载体 中间载体： 带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒的衍生载体称为”中间载体” 原理：大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性 目的：把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入Ti质粒中。 中间表达载体：是由中间载体（含选择标记）加上能在植物细胞中表达的启动子及目的基因构成，也就是嵌合基因插入中间载体后构成。 嵌合基因（chimeric gene） 就是来自两种或两种以上生物的启动子、结构基因、终止子连接在一起构成基因。 中间表达载体-启动子及调控序列 Ti质粒 Nos、Ocs等基因具有与真核生物启动子类似的TATA盒和CAAT盒，均能在植物细胞中表达，并且无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子，其中以Nos启动子（pNos）最常用。 CaMV的35s启动子 花椰菜花叶病毒DNA的CaMV的35s启动子能使嵌合的外源基因在植物细胞中表达。 为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中分离其编码蛋白（酶）的基因，创造出有价值的新物种。 中间表达载体-选择标记 供植物转化体的选择标记： 新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ) 卡那霉素抗性基因(kanr) 潮霉素B磷酸转移酶基因，可抗潮霉素(hygr) 氨苄青霉素抗性(Ampr) 四环素抗性(Tcr ) 庆大霉素抗性(Genr) Cat（氯霉素乙酰移酶基因） Cat也是应用得较多的一种报告基因。它来自细菌转座子Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因的结构基因。 植物遗传转化载体系统 一元载体转化系统 这类载体是中间表达载体与改造后的受体Ti质粒之间，通过同源重组所产生的一种复合型载体。 一元载体系统目前主要有两种载体： 一元载体转化系统-共整合载体 共整合载体的特点是： 中间表达载体与受体Ti卸甲载体，通过同源重组共整合而构建； 中间表达载体与受体Ti质粒之间同源序列是pBR322 一元载体转化系统-拼接末端载体 拼接末端载体（sp1it-end vecter ,SEV） 1985年建立的，因它的两个LIH序列在同源重组前分别处于不同质粒上而得名。 一元载体转化系统-pGV3850与SEV比较 共同点: 两者都是通过受体Ti质粒与中间载体同源重组而形成，故同属于一元载体系统。 不同点： 受体Ti质粒与中间载体的结构不同。 同源序列不同。 SEV是更有效的共整合载体。 一元载体转化系统-特点 由两个质粒（E.coli质粒和Ti质粒）重组而成，分子量较大； 共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关,相对较低； 必须用Southern杂交或PCR对大的共整合体质粒进行检测； 构建时比较困难。 双元载体转化系统-概念 是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统,又因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式