ppt课件-第一章 克隆载体.pptVIP

第3节 染色体定位整合载体 染色体定位整合平台系统(gene integration platform system) 整合平台：外源DNA整合位置 克隆载体: 除一般质粒特征外，具有与整合 平台同源的DNA序列 基因打靶(gene targeting) 基因定点同源重组(site-specifichomologus recombination) 定位整合克隆载体的几种模式: (1)内源平台双交换置换克隆载体 (2)外源平台双交换置换克隆载体 (3)内源平台双交换插入克隆载体 (4)内源平台单交换插入克隆载体 定位整合克隆载体的定位整合效率 (1)受体细胞 (2)同源DNA片断长短 总体上整合效率偏低 第4节 人工染色体克隆载体 大片段克隆载体 显著特点是载体的容载能力扩大,约100～350kb?,主要有: 酵母人工染色(yeast?artificial?chromosome?,YAC)? 细菌人工染色体(?bacterial?artificialchromosome?,BAC)? 源于噬菌体P1?的染色体(Pl2derived?artificial?chromosome?,PAC)? 酵母人工染色体(?YAC) YAC 载体的复制元件是其核心组成成分: 大肠杆菌中复制起始位点(ori) 其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列（autonomously replicating sequence， ARS） 用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒 （centromere , CEN） 两个端粒（TEL） 筛选主要是营养缺陷型 (2)Vir区（virulence region） 该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒区。 T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。 (3)Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之 间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。 (4)Ori区（origin of replication） 该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。 双元载体系统（binary vecter） ： 由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统,又因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移,故称之为反式载体（trans vecter） 双元载体系统的构建原理 (1)双元载体主要包括两个Ti质粒，即微型Ti 质粒和辅助Ti质粒 (2)Ti质粒上的Vir基因与T-DNA具有反式互 补作用，Vir基因可以反式激活T-DNA的 转移。其次，中间载体含有广泛寄主范围 质粒的复制起始点（oriV），而代替了共 整合载体中用以重组的同源区，能够在任 何农杆菌寄主里自发复制。 TA克隆载体 第2节 病毒(噬菌体)克隆载体 病毒： 　DNA（或RNA）和外壳蛋白 噬菌体： 　感染细菌的病毒 病毒与宿主关系来分： 温和型病毒 　　构建载体的好材料 烈性病毒 　　通过改造，也可用于构建载体 一. 噬菌体 λ溶源性细菌特点： 超感染免疫性 溶原性细菌诱发进入溶菌周期 att位点 attL attR 噬菌体插入大肠杆菌基因组方式 Champbell模型 λ噬菌体 粘末端结合成的双链称为Cos位点 构建λ噬菌体的基本策略与技术路线： (1)去除λ非必须区 λ噬菌体包装: 大小51-36.4kb之间 野生型大小为48.5kb 去除非必须片断(复制、裂解等非必须)， 使包装片断尽可能大 同时，抹去一些酶切位点 插入型载体 替代型载体 gtWESλB 替换型： 最大可达15.5 最小0.7kb 插入型： 不大于10.6kb (2)标记基因 Spi- ：外源取代red、gam基因 lacZ基因: 蓝白斑 (3)建立外包装系统 转染(transfection)：裸露DNA 转导(transduction)：包装后，噬菌体颗粒介导 宿主细胞中λ噬菌体的包装过程 头部: E蛋白占72%：头部主要组成成分 琥珀突变导致尾部蛋白积累 D蛋白占20%: DNA进入头部前体以及头部