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第二节 原生质体培养 一、培养基 二、培养方法 4、饲养层培养 二、融合方法 (一)无机盐诱导融合: NaNO3法 1972年： Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。 （二）高pH-高Ca离子法 （三）PEG法 （四）PEG结合高钙-高pH诱导法 最为常用。 具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体细胞团---筛选---再生杂合细胞 异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色 异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色 本章小结： (1) 原生质体培养的意义：(1)再生植株； (2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。 (2) 原生质体分离方法：机械分离法、酶法分离。 (3)酶的种类及特点 (4)原生质体的纯化方法：离心沉淀法；漂浮法；界面法。 (5)原生质体活力的测定：形态识别；染色识别。 本章小结： （6）原生质体培养方法：液体浅层培养；平板法培养；悬滴法培养；双层培养法；饲喂层培养 （7）原生质体融合的方法：无机盐诱导融合；聚乙二醇与高pH高钙相结合的诱导融合；电融合技术。 （8）杂种细胞的筛选与鉴定：互补选择；机械分离杂种 细胞法；双荧光标记选择法 （9）杂种植株的鉴定：形态学鉴定；细胞学观察；DNA内切图谱分析；同工酶分析 * * pH 渗透压 钙镁 生长物质 氮源 碳源 培养基 第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交 培养方法 液体浅层培养 平板培养法 双层培养法 饲养层培养法 第二节、原生质体培养 1、液体浅层培养 第二节、原生质体培养 原生质体悬浮液 1mm厚液体培养基 2x105/ml 2、平板培养 原生质体纯化、离心、稀释后，再与1.4%琼脂或琼脂糖（37?C左右）等体积混合成0.7% ，培养于培养皿中。 第二节、原生质体培养 3、双层培养法（固、液培养） 培养皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。 第二节、原生质体培养 4、饲养层培养 方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.7%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。 第二节、原生质体培养 方法二：X-射线杀死原生质体，与0.7%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.7%琼脂混合，培养于饲养层上。 第二节、原生质体培养 定义：原生质体融合也叫做体细胞杂交，使分离出来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。 第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交 第三节、原生质体融合 一、原生质体融合意义 —克服杂交不亲合 —克服生殖器官败育 —克服柑桔多胚 第三节、原生质体融合 无机盐诱导融合 高pH-高Ca离子 聚乙二醇(PEG)法 PEG结合高钙-高pH诱导法 电融合技术 第三节、原生质体融合 NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原 生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起 不足：诱导频率不高。 第三节、原生质体融合 1973年：Keller用pH10.5的50 mM CaCl2溶液在37℃时，诱发烟草叶肉原生质体融合。 优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。 第三节、原生质体融合 PEG法特点： 融合频率高 可重复性强 诱发融合无特异性 毒性较低 植物+植物 植物+动物 动物+酵母 第三节、原生质体融合 PEG法原理 PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。 第三节、原生质体融合 第三节、原生质体融合 (五)电融合技术 Senda 1979年首先用此方法实现原生质体融合 第三节、原生质体融合 三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定 1．互补选择法 第三节、原生质体融合 2、机械分离杂种细胞法 3. 双荧光标记选择法 3. 双荧光标记选择法 第三节、原生质体融合 四、体细胞杂种植株的鉴定 形态学鉴定 细胞学观察 DNA内切图谱分析 同工酶分析 第三节、原生质体融合 第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交 第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交