仔猪黄痢病原菌药敏实验课稿.doc

引言仔猪黄痢是由产肠毒素性大肠杆菌引起的临床常见的传染病，又称初生仔猪大肠杆菌病或仔猪早发性大肠杆菌病, 大肠杆菌是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成成分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有致病性，尤其是对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症[1]。产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是一类致人和幼畜（初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪）腹泻最常见的病原性大肠杆菌，由粘附素和肠毒素共同作用而致病。初生幼畜被ETEC感染后常因剧烈水样腹泻所致脱水而死亡，发病率和死亡率均很高，如仔猪黄痢。 在猪的规模化养殖中，仔猪黄痢是危害严重的常见多发病之一，仔猪十分易感。该病具有很强的条件致病性，饲养管理不良，猪舍卫生条件差，天气骤变，供水不足和拥挤等诸多应激因素均可使猪只抵抗力降低而诱发本病。仔猪黄痢、白痢在世界各地均有报道，美国新生仔猪下痢中48% 是由大肠杆菌引起的。朱瑞民( 1988) 统计表明, 台湾有15~ 25%的仔猪因此病无法育成, 每年直接损失316~ 619 亿元; 据统计, 我国1997 年1~ 6 月猪大肠杆菌病发病数104511 头, 直接经济损失达5 千万元以上。由于仔猪黄、白痢及与其他病混合感染, 使提仔猪死亡率达60% 以上。随着养猪业的规模化发展，该病发病率有明显上升趋势，危害十分严重，造成巨大的经济损失[5]。 近些年来，抗菌药物的耐药性变为全球关注的热点，英国上议院和WHO报告表明抗菌药在家畜中的滥用和不合理应用是抗菌药物耐药性产生的重要源头。由于抗菌药物的长期使用，造成猪源大肠杆菌耐药株越来越多，耐药谱越来越广，多重耐药性呈上升趋势。方雨玲[6]等(1992)用18种抗菌药物对231株ETEC菌株进行了敏感性结果表明氨苄青霉素、庆大霉素、卡那霉素、强力霉素、四环素、氯霉素、磺胺、痢特灵等原来对革兰氏阴性杆菌有很强抑菌或杀菌作用的药耐药性显著增加，四环素、土霉素等已极少有敏感菌株，对革兰氏阳性菌杀菌作用的红霉素等对本菌基本没有作用。因此有必要通过大肠杆菌的药敏试验为临床用药提供依据。 1 材料和方法 1．1 实验材料 临床菌株：从黄痢仔猪中经分离鉴定得到的大肠杆菌 药敏质控菌株：ATCC 25922大肠杆菌，购于中国兽药监察所 药敏纸片：洁霉素、强力霉素、红霉素、四环素、卡那霉素、青霉素、氨苄西林、复方新诺明、羧苄青霉素、先锋霉素IV、先锋霉素V 、丁胺卡那霉素、磺胺甲基异恶唑、环丙沙星、奥复星、新霉素 、链霉素、庆大霉素、阿莫西林、恩诺沙星、氟苯尼考购于佰易聚生物商城 抗菌药物贮存液：卡那霉素溶液、盐酸恩诺沙星水溶液购于浙江国邦药业有限公司，批号：110131291 普通营养肉汤培养基、普通琼脂培养基购于广东环凯微生物科技有限公司 1.2 实验仪器 净化工作台、天平、试管、三角瓶、培养皿 、酒精灯、高压灭菌锅、干燥箱、培养箱、酒精灯、镊子、接种环、玻璃移液管、移液枪、试管架、烧杯、玻璃棒、游标卡尺。 1.3 培养基的制备 1.3.1 普通肉汤培养基的配制步骤： 称量 用天平按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g准确称量，置于烧杯中再加入1000ml蒸馏水搅拌均匀。粉末状原料用滤纸直接称量，固体状用烧杯称量。 配制 将上述成分混合加热溶解，搅拌使其混合均匀，以看到气泡完全溶解为宜。加热时要控制火力，不要使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发的水分。 调节PH值 待配制好的培养基稍微冷却后，用玻璃棒蘸取少许，用标准pH试纸测其酸碱度，初配好的牛肉膏蛋白胨培养液是偏酸性的，故要用NaOH调整。为避免过碱，应缓慢加入NaOH，边加边搅拌，并不时地用PH试纸测试，调整pH至7.2-7.4。也可以取培养基5ml于干净试管中，逐滴加入NaOH调pH至7.4-7.6，并记录NaOH的用量，再换算出培养总体积中须加入NaOH数量，即可调至所需的pH范围。 过滤 将pH测定后的肉汤培养基用滤纸过滤 分装 根据需要，将pH的肉汤培养基溶液，乘热倒入三角瓶装量不超过容积1/21/4-1/5），然后给三角瓶和试管都塞上棉花塞。试管要摆成斜面，可在桌子上放一跟玻璃棒，然后再把试管口一边放在玻璃棒上是培养基溶液形成斜面。 灭菌 将分装好且塞上棉塞的三角瓶用报纸包住并用绳子绑紧；将分装好的试管塞上棉塞，再用报纸包住试管口的那一段，一次可以包8~10支，然后用绳子绑住，放入高压蒸汽灭菌锅内的套筒中，将灭菌锅盖的排气管插如套筒侧壁的凹槽内，关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，高压灭菌，121℃灭菌15-30min. 1.3.2营养琼