第七章重组与鉴定2014题库.ppt

一 、 DNA的体外重组（切与接） 同种内切酶产生的粘性末端的连接 同尾酶生产的粘性末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接 粘性末端的更换 重组率 (1) 同种内切酶生产的粘性末端的连接 (2) 同尾酶生产的粘性末端的连接 (3) 不同种酶产生的粘性末端的连接 用两种限制性内切酶分别消化载体和外源DNA片段,使载体和外源目的基因的两端分别形成不同的粘性末端.将它们混合,在连接酶的作用下相同的粘性末端可退火形成重组DNA分子,实现DNA定向连接. (4) 不同粘性末端的连接 (5) 人工粘性末端的连接 5‘突出末端 (6) 人工粘性末端的连接 3‘突出末端 平末端DNA片段的连接 同聚物加尾法 衔接物加尾法 DNA接头连接法 DNA接头连接法 接头:人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段 PCR 产物的连接 引入酶切位点 在引物两端引入限制性内切酶位点,同时要加3-4个保护碱基,或突变碱基创造酶切位点 T/A克隆 目前使用最广泛的PCR产物克隆方法 平末端克隆 5.载体和外源DNA插入片段的连接结果 载体自身环化连接（能存活) 载体之间互相连接（能存活) 插入片段互相连接（不能存活) 一个载体与1个插入片段重组（能存活） 几个载体与一个插入片段重组（能存活） 重组率 重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作 提高重组率的方法 提高外源DNA片段与载体的分子比：3 : 1 - 10 : 1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团： 二、 重组DNA分子的转化和扩增（转与增） 转化 转染 感染 转化：指 感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程。 转染：专指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。 (一) 转化 1 细菌常用的转化方法　 热激法转化感受态细胞 PEG介导的原生质体转化 高压电穿孔法转化 显微注射法转化 接合转化 噬菌体转染 1、Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态 感受态细胞(Competent cells):就是处于能吸收外源DNA的生理状态的细胞. 2、聚乙二醇 (PEG )介导的细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化 细菌原生质体的制备 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂 细菌原生质体的转化 取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10 - 20 ml DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀 细菌原生质体的再生 原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素 3、电穿孔转化 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大 4、 结合转化法 通过细菌供体细胞同受体细胞间的直接接触而传递外源DNA的方法。尤其适用于那些难以采用前面一些方法进行重组质粒DNA分子直接转化的受体菌。转化过程是由接合型质粒完成。 （二）感染 将以l噬菌体为载体的DNA分子包装成病毒颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染。 （三） 转染 以噬菌体为载体，但不经过蛋白包装成病毒颗粒，而是用DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转化方式导入受体菌的过程。 感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600 = 0.5 吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟 转染裂解:加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液中