第二代高通量测序的三大巨头比拼.docVIP

第二代高通量测序的三大巨头比拼（之一） 第二代高通量测序准确率，延长度都明显优于第一代高通量测序，更重要的是，价格比第一代大幅度降低，使得高通量测序的产业化成为现实。第二代高通量测序仪的三大代表是Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)，罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roch GS FLX sequencer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD se-quencer)。 摘要：第二代高通量测序准确率，延长度都明显优于第一代高通量测序，更重要的是，价格比第一代大幅度降低，使得高通量测序的产业化成为现实。 Illumina公司的Solexa基因组分析仪  Illumina公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由Solexa公司研发，利用其专利核心技术“DNA簇”和“可逆性末端终结（reversible terminator）”，实现自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。Genome Analyzer作为新一代测序技术平台，具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学 （基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。1、Genome Analyzer技术的基本原理：  Solexa 方法是利用单分子阵列测试 genotyping ，此种测序法首先将 DNA 从细胞中提取，然后将其打断到约100－200bp大小，再将接头连接到片段上，经 PCR 扩增后制成 Library 。随后在含有接头的芯片（flow cell）上将已加入接头的 DNA 片段绑定在flow cell上，经反应，将不同片段扩增。在下一步反应中，四种荧光标记的染料应用边合成边测序的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链DNA分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。荧光信号被CCD采集，CCD快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。  Solexa的这种方法，可在一个反应中同时加入4种核苷的标签，采用边合成边测序（SBS－sequencing by synthesis），可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点，此反应可以同时检测上亿个核苷酸片断 , 因此在同一个芯片或几个芯片上花费很少（只需常规方法的1％）的成本就可测试全基因组。2、Solexa高通量测序技术特点：1）可扩展的超高通量：Genome Analyzer系统目前每次运行后可获得超过20GB的高品质过滤数据。这个技术的可扩展性保证了更高的数据密度和输出，能用更少的经费完成更复杂的项目。到今年底，通量还有望上升到95 GB，相当于人类基因组的30倍覆盖度。2）需要样品量少：Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng，能应用在很多样品有限的实验（比如免疫沉淀、显微切割等）中。这也是很多研究人员所考虑的因素。3）简单、快速、自动化：Genome Analyzer 系统提供了最简单和简洁的工作流程。即使是最小的实验室也能像大型基因组中心一样进行大规模的实验。制备样品文库可以在几小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据。Cluster Station可以说是Genome Analyzer的核心。由独立软件控制的自动生成DNA簇的过程可以在5小时之内（30分钟手工操作）完成。这个自动化的流程不需要进行Emulsion PCR，减少了手工操作误差和污染可能性，也不需要机器人操作或洁净室。快速的实验流程使Genome Analyzer的能力增至最大，而自动化步移降低了项目的时间和费用。4)新颖的测序化学技术：Genome Analyzer通过合成测序来支持大规模并行测序。利用新颖的可逆荧光标记终止子，可以在DNA链延伸的过程中检测单个碱基掺入。由于四个可逆终止子dNTP在每个测序循环都存在，自然的竞争减少了掺入的误差。5)单个或配对末端支持：Genome Analyzer 系统支持单个片段或配对末端文库。文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间。制备基因组DNA的单个片段或配对末端文库需要6个小时，只有3个小时需要手工操作。2