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基因工程 遗传学角度：一项遗传学技术 将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，创造生物新品种或新物种的遗传学技术 无性繁殖：称之为“克隆” 行使正常功能：称之为“表达” 基因工程生物化学角度：重组载体的操作 在体外，将各种来源的DNA片段与载体DNA结合成一个重组载体；重组载体可转化或转染宿主细胞，并在宿主细胞内表达，产生特定的基因产物。 DNA片段：同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的 载体DNA ：病毒、细菌质粒或噬菌体 有关术语解释： DNA嵌合体（DNA chimera） ：内、外源DNA插入载体分子所形成的杂合分子（嵌合DNA） 重组（ recombination）：构建DNA嵌合体分子的过程 克隆（molecular cloning）：重组体分子的无性繁殖过程 克隆羊“多利” “多利”诞生过程 体细胞克隆 日本农林省畜产试验场日前宣布，日本第一头体细胞克隆山羊2000年11月12日在该场诞生 雄山羊脑下垂体的前叶细胞，把它置于除去细胞核的卵细胞内，经过培养使它们相互融合，然后植入母山羊的子宫中。克隆山羊诞生时体重为1.45公斤 迄今为止，日本已经开发成功克隆牛、克隆猪等体格较大哺乳动物的技术，并且通过培育再克隆牛，证明了雄雌克隆牛都有正常的生殖能力 克隆人 美国内华达州克罗耐德秘密实验室：克隆人 具体操作：从一个今年2月份刚刚夭折的10个月大的美国女婴身上提取细胞，取出细胞核保存起来；接着把细胞核植入一名妇女自愿捐赠的成熟卵子中，再用电流刺激这个经改造过的细胞体，从而创造一个全新的胚胎；最后把这个胚胎植入一个妇女自愿者子宫中怀孕，诞生下来的小宝宝就是世界上第一个克隆人——跟那个夭折的女婴一模一样的克隆婴儿 世界上第一个克隆人将于2001年年底诞生 克隆人 多家机构宣布：不能接受克隆人 美国生殖医学协会（ASRM） 美国最高生殖伦理咨询机构——医学和伦理学团体 日本政府在2000年9月29日召开的自民党科学技术部有关克隆人制度的会议上宣布，对克隆人行为将处以监禁10年以下、罚款1000万日元以下的惩罚 法将允许克隆人体器官 法国总理若斯潘（2000年9月28日）表示： 法国政府将允许对人体器官克隆技术进行用于医疗目的的研究 基因工程技术 上游技术（upstream） 重组子的构建 工程菌的构建及高效表达 下游技术（downstream） 工程菌大规模发酵最佳参数的确定 新型生物反应器的研制 高效分离介质及装置的开发 分离纯化的优化控制 生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造 超滤、反渗透技术的应用 基因工程技术 上游技术十分重要 下游技术更为重要 实验室成果的产业化、商品化 我国现代生物技术与国际水平相比 上游技术落后3—5年 下游技术落后15年以上 基因工程 基因操作技术 （gene manipulation techniques ） 遗传工程（genetic engineering） 重组体DNA技术 （ recombinant DNA techniques ） 分子克隆（molecular cloning） 基因工程操作流程 基因重组示意图 基因工程上游技术基本过程 选择载体 获得目的基因 目的基因与载体的重组 重组载体的转化 重组子的筛选与鉴定 载体（vector） 质粒（plasmid） 噬菌体（phage） 病毒（virus） 载体的条件 ? 分子小（? 10 Kb） ? 有限制酶酶切位点 ? 可自主复制 ? 有足够的copy数 ? 带筛选的标志 载体 克隆载体 表达载体 原核表达载体 真核表达载体 报告载体 克隆载体 外源基因不表达 早期使用的克隆载体的典型代表 pBR322，目前已较少使用，多被用作构建新克隆载体的起始材料 pUC 由pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制子与大肠杆菌?-半乳糖苷酶?（lacZ?）基因融合而成 表达载体 含有强启动子的载体 外源基因可在启动子的控制下转录成mRNA，并最终以蛋白质的形式在宿主细胞中表达 原核表达载体：有两类 可直接表达不含任何原核序列的外源蛋白（原核表达载体） 以融合蛋白的形式进行表达（原核基因融合表达载体） 表达载体 真核表达载体含有： 原核基因序列 真核转录单位 真核表达载体：有两类 不带病毒复制子 带病毒复制子 报告载体 — 1 一种易于用生化方法检测的基因作为报告基因，通过其表达强度的高低来研究外源调控因子（如启动子、增强子等）的功能 通常由p-Basic、p-Enhancer、p-Promoter、p-Control组成 p- Basic缺少真核启动子和增强子序列，可最大程度地克隆可能的调控元件，报告基因的表达活力依