过氧化氢酶的活力和动力学常数测定.docxVIP

一、酶活力测定（一）原始数据1.样品原始质量：嫩豆芽5.010g2.标定数据：（1）KMnO4质量数及配制：0.02mol/L高锰酸钾标准液配制：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL ，临用前用草酸钠标定。（2）Na2C2O4质量数：称取优级纯Na2C2O4 13.4g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。（3）标定数据：取5mL0.1mol/L的草酸和3mL10% H2SO4溶液于锥形瓶中，加热至（75～85）℃（见冒热气），趁热用KMnO4标准溶液滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴KMnO4标准溶液摇动，待溶液褪色，再加第二滴KMnO4（此时生成的Mn2+起催化作用）。随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但滴定中始终不能过快，，不断摇动或搅拌。滴定至溶液呈现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。2KMnO4+5Na2C2O4+8H2SO4=2MnSO4+5Na2SO4+K2SO4+10CO2↑+8H2O（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L3.样品滴定数据编号活酶死酶1212加入酶液体积(mL)2.52.52.52.5加入10%H2SO4体积(mL)2.52.52.52.5加入0.1ml/LH2O2体积(mL)2.52.52.52.5加入KMnO4体积(mL)0.230.241.901.94（二）结果计算1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2）2KMnO4+5H2O2+2H2SO4=K2SO4+MnSO4+5O2↑+2H2O2 5 2 1 1 5 2 1.9*10-5 4.75*10-5 m(H2O2)=4.75*10-5*34*1000=1.615mg2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g?min）酶活力用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示酶活(mgH2O2/g·min)=式中： A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数； VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）； F W—样品鲜重（g）； 1.7—1ml 0.02mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2酶活(mgH2O2/g·min)=0.235*50*1.7/(5.010*2.5*10)=0.159(mgH2O2/g·min)二、动力学常数的测定（一）原始数据编号12345消耗的KMnO4（mL）0.280.350.410.721.33（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度V0编号12345[S]0 （mol/L）5.000*10-36.700*10-38.700*10-31.250*10-22.500*10-2V0 （mmol/min）7.340*10-31.008*10-21.351*10-22.391*10-23.737*10-2（三）以1/V0对1/[S]0作图（用excel作图）（四）求出Km（mol/L）和Vmax（mmol/min）求得线性关系为y=1.3921x+0.0111所以Vmax=1/0.0111=8.654*10-2 KM=1.205*10-1第四部分：课后研讨题1.总结本实验操作过程的注意事项。(1)每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min。(2)各反应瓶的滴定终点微红色应为同一标准。(3)使用前，应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。2.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?温度，pH值和底物浓度3.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和氧分子，在此过程中起传递电子的作用。4.在反应速度的测定中，加入硫酸有哪些作用？提供反应所需的酸性条件，并作为反应物参与反应5.米氏方程中的Km有何实际应用？(1)鉴定酶：通过测定Km,可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同反应的酶是否是属于同一种酶。(2)判断酶的最适底物（天然底物）。(3)计算一定速度下底物浓度。(4)了解酶的底物在体内具有的浓度水平。(5)判断反应方向或趋势。(6)判断抑制类型。6.在什么条件下，酶的Km可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质有关，与酶浓度无关。因此，当底物、PH、温度和离子强度等条件相同时Km值为常数，对一酶促反应而言，在一定的条件下都有特定的Km值，可用来鉴别酶。7.测定酶活力为什么要在进程曲线的初速度时间范围内进行？要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间并不是任意