2013SABC法.pptVIP

免疫组织化学SABC染色法 原理： SABC法是利用链霉卵白素与生物素特有的高度亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后与链霉卵白素按一定比例混合，形成SABC复合物。特异性抗体与抗原结合后，用生物素化二抗起桥连作用，形成抗原—抗体—生物素化二抗—SABC反应链。最后用底物显色剂显色。 实验常用试剂 0.01M PBS (pH=7.2～7.4) 3% H2O2（或0.3%H2O2-甲醇） 原液H2O2 用双蒸水1:10稀释——3% 原液H2O2 用甲醇1:100稀释——0.3% 封闭剂：5% BSA(Bovine Serum Albumin) 试剂盒 第一抗体（specific antibody） 抗人EGFR （poly-Ab） 抗人PCNA（Mc-Ab） 生物素化的二抗(Biotinated-Ab) 山羊抗兔lgG (anti-rabbit) 山羊抗鼠lgG (anti-mouse) Streptavidine-Biotin-HRP 复合物（SABC） 显色剂（博士德）： 浓缩DAB H2O2 Buffer 实验步骤: (1) 石蜡切片脱蜡、梯度酒精下行入水； (2) 3%过氧化氢溶液，室温10min(灭活内源性酶)；自来水冲洗，PBS洗1次。 (3)滴加封闭剂：每张切片滴加5% BSA（或二抗同源的非免疫动物血清）100ul。室温 20min；甩去多余液体，不洗！ (4)每张切片滴加适当稀释（1:100）的第一抗体，37℃，40-60min (5) PBS浸洗2min，×3次（可用吸管吸取PBS，从载玻片一端轻轻冲洗3 ～ 5次） (6)每张切片滴加生物素化第二抗体100?l，37℃，20min； (7) PBS浸洗2min，×3次（同步骤“5”）； (8) 每张切片加1滴（约50?l）SABC，37℃，20min； (9) PBS浸洗3min，×3次（同步骤“5”）； (10)滴加新鲜配制的DAB显色溶液（按说明书配置），覆盖整个标本，室温显色 5～10min； (11)自来水充分冲洗，苏木精轻度复染（10s）。 (12) 脱水，透明，中性树胶封固。显微镜观察 注意事项 1 阴性对照：用PBS代替第一抗体； 2 所有反应在湿盒中进行； 3 在染色过程中勿使切片干燥 ； 4 洗完切片后应尽量吸去组织切片周围液体； 5 掌握微量加样器的正确使用方法； 6 DAB为致癌剂，使用时加倍小心。 结果判断标准 必须掌握的一些原则： 阳性细胞定位是否明确，是胞膜、胞浆还是胞核？ 间质清晰，无背景着色。 阳性细胞要在5%以上，才能定为阳性。 参考评价： 5% - ， 5%-25% + ， 25%-50% ++， 50% +++ ～++++ 胞浆阳性 胞浆阳性 胞膜阳性 雌激素受体β在乳腺癌的表达 胞核阳性 P53 胞核阳性 * * 非免疫动物血清（与二抗同源） * * * 非免疫动物血清（与二抗同源） *