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实验二、 细胞培养的基本知识和准备 为什么要进行细胞培养 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内（in?vivo）的功能活动是十分困难的。但是如果把活细胞拿到体外（in?vitro）培养进行观察和研究，则要方便得多。活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存活和进行生理活动，特别是高等动植物细胞要求的生存条件极其严格，稍有不适就要死亡。所以细胞培养技术（cell?culture）就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。 细胞培养的优点 1.便于应用物理、化学、生物等外界因素探索和揭示细胞生命活动的规律； 2.便于应用各种不同技术方法研究和观察细胞结构和功能的变化； 3.可以长期研究和观察细胞遗传行为的改变； 4.可以提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象。 第一部分.细胞培养的基本知识 （一）培养细胞的类型及其特点 体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，根据其生长方式（即根据它们是否能贴附在支持物上生长的特性）可分为贴附型和悬浮型两大类。 （1）贴附型 大多数培养细胞均为贴附型，它们必须贴附在支持物表面生长，这类细胞在体内时各自具有其特殊的形态，但在体外培养时贴附于支持物后形态上表现单一化而失去体内原有的某些特征，细胞形态仅大致分成以下四型： 体外培养贴附型细胞形态 1、成纤维样细胞：胞体多呈梭形或柳叶形或不规则三角形 ，且具有长短不等的数个细胞突起。中央有卵圆形核，其生长时一般不会紧靠连接成片，而是排列呈涡旋状、放射状，或似栅栏状。 培养细胞的类型及其特点 2、上皮样细胞：细胞多呈扁平三角形或不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。皮肤表皮以及消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 3、游走样细胞：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。4、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。 (2) 悬浮型 少数细胞在培养时不贴附于支持物上，而以悬浮状态生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞。 细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小的细胞团，胞体为圆形。 其优点是在培养液中生长，生存空间大，允许长时间生长，便于大量繁殖。 培养细胞的生长和增殖过程 培养细胞的生命期 培养细胞的生命期（life span）指的是细胞在培养中持续增殖和生长的时间，一般可分为原代培养期、传代期和衰退期。 1．原代培养期 原代培养也称初代培养，是从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。一般持续1-4周。 2．传代期 传代期通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系（cell line）。进入传代期，此期在全生命期中持续时间最长，细胞增殖旺盛，一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。 3．衰退期 处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。 以上主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性（immortality）或恶型性malignancy）的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系（infinite cell line）或连续细胞系（continuous cell line 培养细胞一代的增殖过程 培养细胞的一代生存期，一般可被分为三个阶段。 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 潜伏期（Latent Phase）： 潜伏期（Latent Phase）： 细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。 初代培养细胞贴附慢，可长达10～24小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，10～30分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。 细胞接种密度大时潜伏期短。 当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。 另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维