谈乳果糖对便秘小鼠结肠水通道蛋白4 表达的影响.docVIP

谈乳果糖对便秘小鼠结肠水通道蛋白4 表达的影响 　　便秘是消化道常见的慢性病症，随着饮食结构变化及精神、心理因素的影响，其发病呈上升趋势，严重影响着人类的身心健康，水代谢紊乱为其主要的发病环节。水通道蛋白(aquaporins，AQP)是特异性转运水的蛋白家族，参与机体水的分泌、吸收及细胞内外水平衡的调节，已有研究发现水通道蛋白3、4、8 等存在于结肠，与结肠水吸收密切相关。渗透性泻药，通过提高肠腔内渗透压，使粪便含水量增加，缓解便秘症状，但其具体作用机制及和水通道蛋白之间的联系尚不明确，本研究通过构建小鼠便秘模型，应用免疫组化和反转录-聚合酶连反应(RT-PCR)方法研究乳果糖对便秘小鼠结肠AQP4 表达情况的影响，探讨乳果糖和AQP4 之间的关系，为临床便秘治疗提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物及分组：健康昆明雄性小鼠30 只，体质量(20.0plusmn;2.0)g，随机分为阴性对照组、便秘模型组、乳果糖治疗组。 　　1.2 便秘模型制备、成功标准、取材： 　　①模型制备：参照文献，便秘组给予50 mg/kg 的复方地芬诺酯灌胃，阴性对照组给予等量的蒸馏水灌胃。灌胃后动物均单笼饲养，正常饮食进水。便秘模型造模成功后，将模型随机分为乳果糖治疗组和便秘模型组，治疗组给予乳果糖(0.6 ml/20 g)灌胃，模型对照组和阴性对照组给予等量的蒸馏水灌胃。 　　② 模型判定标准：观察阴性对照组与便秘模型组小鼠首粒排便时间、12 h内排便粒数和排便重量数值比值，差异有统计学意义(Plt;0.05)，便秘模型制备成功。 　　③取材：实验小鼠以水合氯醛腹腔麻醉并处死，迅速取升、降结肠组织各1 块，置于-85 ℃冰箱，供RT-PCR 使用。 　　1.3 RT-PCR 测定结肠AQP4mRNA 表达： 　　选用beta;-肌动蛋白基因为内参照引物基因，反应中所用的上游引物为：5prime;-CTACAATGAGCTGCGTGTGCC-3prime;，下游引物为5prime;-CAGGTCCAGACGACGCAGGATGGC-3prime;，扩增产物为：270 bp;AQP4(Genbankaccession number U14007)上游引物为：5prime;-GGGTTGGACCAATCATAGGCGCT-3prime;(701-723)，下游引物为：5prime;-GCAGGAAATCTGAGGCCAGTTCTAGG-3 (1030-1005)，扩增产物为：330 bp。cDNA 序列查自基因库，2 对引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。反应步骤及反应体系见MBIFermentas 公司试剂盒说明，AQP4 反应条件为94 ℃ 30 s，62℃ 30 s，72 ℃30 s，共36 个循环;beta;-肌动蛋白反应条件为94℃ 20 s，58 ℃ 30 s。72 ℃ 30 s，共35 个循环。琼脂糖凝胶电泳及半定量分析：取PCR 扩增产物5 mu;l，置1%琼脂糖凝胶中，TBE 电泳缓冲液中4 V/cm 电压电泳60 min，用GDS7500图像分析系统(英国UVP 公司)进行密度扫描定量，以AQP4基因与beta;-肌动蛋白比值表示AQP4 mRNA 的相对表达量。 　　1.4 统计学处理： 　　计量资料以xplusmn;s 表示，所有数据均用SPSS17.0 软件分析。AQP4 表达量的比较采用析因设计的方差分析，Plt;0.05 为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 小鼠便秘模型及药物干预结果： 　　20 只便秘模型(包括乳果糖治疗组用药前)小鼠与阴性对照组比Y较，首粒排便时间明显延长，12 h 内排便粒数、排便质量明显减少(Plt;0.01)，便秘模型制备成功。乳果糖治疗组(用药后)与阴性对照组以上指标差异无统计学意义(Pgt;0.05)，与便秘模型组比较上述指标差异有统计学意义(Plt;0.01)，说明用药后便秘症状改善，药物治疗有效。