谈清下化瘀方对急性胰腺炎大鼠胰腺细胞Survivin、XIAP 及Smac 的影响.docVIP

谈清下化瘀方对急性胰腺炎大鼠胰腺细胞Survivin、XIAP 及Smac 的影响 　　急性胰腺炎( acute pancreatitis，AP) 是由多种病因导致胰酶在胰腺内被激活后引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症反应。其中重症急性胰腺炎( severe acute pancreatitis，SAP) 常并发多脏器功能衰竭及全身炎性反应综合征，病死率极高。近年研究发现，AP 的严重程度与胰腺腺泡细胞凋亡密切相关。Survivin、X 连锁凋亡抑制蛋白( XIAP) 和低等电点的凋亡抑制蛋白( IAP) 直接结合蛋白( Smac) 均属细胞凋亡相关蛋白。清下化瘀方系根据多年临床经验总结而成的复方，在既往临床应用中，发现其可明显改善AP 患者的临床症状，促进疾病康复。本研究通过对清下化瘀方及其拆方干预后AP 大鼠胰腺组织中Survivin、XIAP 和Smac 的mRNA 及蛋白表达水平的检测，探讨清下化瘀方的作用机制。 　　1 材料与方法 　　1. 1 实验材料 　　1. 1. 1 动物8 周龄雄性SD 大鼠84 只，体质量( 248. 02 plusmn; 24. 53) g，清洁级，由中国科学院上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK( 沪) 2012-0002。置于清洁级动物饲养室，20 ～24℃，光照和黑暗各12 h 交替，自由进食标准颗粒饲料及饮水。 　　1. 1. 2 药品和试剂牛磺胆酸钠，购于美国Sigma公司( 批号: CAS145-42-6) ; 戊巴比妥钠，购于国药集团化学试剂有限公司( 批号: US ; 生长抑素采用醋酸奥曲肽注射液( 善宁) ，购于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院急诊药房( 0. 1 mg /ml，诺华制药厂产品) ; Trizol 试剂盒，购于Invitrogen 公司; RT 试剂盒和Sybr green，购于TAKARA 公司; 氯仿和异丙醇，购于国药集团化学试剂有限公司。XIAP 上下游引物分别为5#39;-ggccagactatgcccattta-3#39;，5#39;- cgaagaagcagttgggaaag-3#39;;Smac 为5#39;- ctcggagcgtaacctttctg-3#39;，5#39;- acagtgtcacaccgaatcca-3#39;; Survivin 为5#39;-ctgatttggcccagtgtttt-3#39;，5 #39;-acggtcagttcttccacctg-3#39;。引物由上海英俊生物技术有限公司合成。清下化瘀方组成: 生大黄9 g，柴胡12 g，延胡12 g，丹参15 g，赤芍15 g，焦山栀9 g，枳实10 g，枳壳10 g，红藤30 g。清下组组成: 生大黄9 g、红藤30 g、焦山栀9 g、枳实10 g; 化瘀组组成:延胡12 g、丹参15 g、赤芍15 g; 疏肝组组成: 柴胡12 g、枳壳10 g。上述各组药物分别加入蒸馏水煎煮25 min，无菌纱布滤去药渣，加水再煎煮15 min，滤去药渣，两次药液混合，浓缩至含生药1 g /ml，放入无菌瓶内，4℃保存备用。 　　1. 2 动物模型制备采用经典胆胰管逆行注射 　　法并进行改良。备皮，新洁尔灭酊消毒腹部皮肤，沿正中切口，长度为2 cm，在无影灯下充分暴露胰腺，用动脉夹阻断胆胰管入肝门处，用微量泵以12 ml /h 的速度、1 ml /kg 的剂量持续匀速输入5%的牛磺胆酸钠，注射完毕后继续维持压力3 min。去动脉夹，观察胰体和胰尾部情况，可见胰腺有明显的出血点和水肿，逐层缝合肌层和皮肤。假手术组仅在常规消毒后开腹翻转胰腺，而后关腹。术后所有实验动物左右后肢皮下各注射生理盐水10 ml /kg，均禁食不禁水。 　　1. 3 分组与干预方法84 只大鼠按随机数字表 　　分为7 组: 假手术组、模型组、生长抑素组、清下组、化瘀组、疏肝组、清下化瘀方组，每组12 只。各组于造模前2 h、造模后1 h 及造模后6 h 各灌服或皮下注射相应药物1 次，按大鼠与人体的每公斤体质量计算剂量折算系数给药，其中假手术组、模型组每次灌服15 ml /kg 生理盐水; 生长抑素组每次皮下注射0. 1 ml /kg 善宁; 其余各组分别灌服对应的中药，按每次15 ml /kg 给药。 　　1. 4 观察指标和方法 　　造模后24 h 取材。对所有大鼠进行麻醉、解剖，胰头部取0. 5 cm times; 0. 5 cm大小的胰腺组织用于HE 染色; 胰尾部取0. 5 cm times;0. 5 cm 大小的胰腺组织放入液氮中保存，用于Survivin、XIAP 及Smac 的检测。 　　1.