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谈清热化湿方调节PI3K - AKT 信号诱导自噬维持胃黏膜稳态防治幽门螺杆菌感染相关胃癌的机制 　　胃癌( gastric cancer，GC) 是多因素、多基因参与的一种源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，属于中国高发肿瘤之一，每年新检出人群超过40 万，平均年死亡率约为16 /10 万( 男性21 /10 万，女性10 /10 万) ，近年死亡率虽有下降但并不明显。尽管幽门螺杆菌( Helicobacter pylori，Hp) 作为I 类致癌因子已为共识，但是关于根除Hp 是否能够达到防治胃癌的目的显然是存在争议。研究发现早期根除Hp 在降低胃癌发生率较后期合并异型增生再行根除Hp 发生率要高，这提示Hp 感染早期所致胃黏膜免疫反应失衡，破坏胃黏膜屏障，导致其他致癌因素更易定植侵袭胃黏膜加重肿瘤的发生有着重要意义。晚近研究发现，PI3K - AKT 信号诱导的胃黏膜上皮细胞自噬异常，导致胃黏膜上皮细胞增殖和凋亡平衡被打破，CDK1、beclin -1 等基因过度转录，最终参与胃癌发生有着重要作用。由此，课题组在前期工作基础上，采用Hp 感染+ MNU 复合法制备胃癌模型，观察清热化湿方防治胃癌的可能机制。 　　1 材料 　　1. 1 实验动物 　　4 周龄雄性Balb - c 小鼠100 只，体质量( 18 plusmn; 2) g，购自湖南斯莱克景达实验动物中心，动物许可证号: SCXK( 湘) 2011 - 0003，动物合格证号: 4304701479。1. 2 试剂与仪器 　　Hp SS1 株( Cag Iota; + ) 由南昌大学第一附属医院消化研究所惠赠，P110、P - AKT、beclin - 1 及CDK1 一抗购自美国SanTa Cruz 公司，P110、P - AKT、beclin - 1 及CDK1 引物合成委托广州达安生物技术公司，蛋白质抽提试剂盒及PCR提取试剂盒均购自广州英伟创津公司，德国蔡司倒置相差显微镜，5417R 低温离心机，BIO - RAD 全自动酶标仪及ABI7500 荧光PCR 仪等。1. 3 实验药物清热化湿方组成: 藿香6 g，川朴3 g，姜半夏4. 5 g，赤苓9 g，杏仁9 g，生苡仁12 g，白豆蔻1. 8 g，猪苓4. 5 g，淡豆豉9 g，泽泻4. 5 g，黄连12 g，栀子12 g。上方6 剂，常规水煎浓缩成500 mL，含生药1 g /1 mL 药液。 　　2 方法 　　2. 1 幽门螺杆菌( Hp) 培养 　　Hp SS1 株复苏后，接种于含10%脱纤维羊血的琼脂培养基，于5%O2、10%CO2、85%N2微需氧条件下培养48 h，经尿素酶及组织染色证实为Hp。用接种环收集细菌，混悬于细菌转送基中，比浊管控制浓度为109 菌落形成单位( CFU) /mL 备用。 　　2. 2 造模方法 　　参照文献报道，全部小鼠适应性喂养1 周后，除正常组外，其余实验小鼠先予每日饮用水中加入新鲜配置抗生素混合液，即庆大霉素15 mg /kg /d; 氨苄青霉素100 mg /kg /d，连续饮用5 d。停药3 d 后，按实验设计将小鼠分为4组，采用Hp 感染结合MNU 法复制胃癌模型，即先予Hp 新鲜混悬液( 109CFU/ml) 0. 3 mL 灌胃，每周3 次，连续8 周;第9 周起，避光新鲜配置120 ppm MNU 自由饮水，连续20周。自第30 周起分组给药，模型组予以等剂量生理盐水，治疗组按低、中、高予以不同剂量清热化湿方水提液灌胃连续10 周。末次给药后处死全部小鼠，沿胃小弯纵轴将胃组织分为两半，一半置于10% 中性福尔马林中备测、另一半用于电镜、分子生物学检测。 　　2. 3 指标检测 　　2. 3. 1 胃黏膜组织病理学及超微结构变化应用 　　HE 染色和透射电镜检测胃黏膜组织病理学变化，及超微结构、细胞自噬改变，其中胃黏膜病理组织学评价参照2012 年中国慢性胃炎共识意见病理评价部分即0 级为正常黏膜、1 级为胃黏膜慢性炎症、2 级为慢性炎症( ++) 、3 级为萎缩性胃炎、4 级为不典型增生和癌变。具体步骤严格按试剂盒操作说明进行，由两名病理科医生盲评。 　　2. 3. 2 胃黏膜P110、P - AKT、beclin - 1 及CDK1 mRNA 表达 　　应用实时荧光定量PCR 技术，以beta; - Actin 为目的基因对照，检测胃黏膜P110、P - AKT、beclin - 1 及CDK1 mRNA表达，具体实验步骤严格按试剂盒操作。P110、P - AKT、beclin - 1、CDK1 及GAPDH 引物序列委托广州达安基因公司合成。内参照beta; - Actin 引物序列为: