02-2蛋白质研究技术.ppt

* 1.5 电泳 A. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）(P298) 使用含有十二烷基硫酸钠（ SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还原）。 经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。由于SDS是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS。 垂直板电泳装置 加样 样品迁移方向 电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。 混合样品 带孔胶 按分子大小分离 电泳方向 电泳 小分子 大分子 夹在两块玻璃板之间的凝胶 电泳缓冲液 电泳缓冲液 加在槽中的经SDS处理的样品 分子量小 分子量大 电源 电泳后的凝胶经考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片 标准蛋白分子量 未知蛋白 在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。 相对迁移率 水平式电泳装置 电泳缓冲液 凝胶 B. 等电聚焦电泳（ IFE） 利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个pH梯度。 每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处。 凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-3） 加电场后在凝胶内形成一个稳定pH梯度 加样品，然后继续电泳 凝胶染色表明样品按照各自pI值沿着pH梯度分布 等电聚焦电泳进行过程中 等电聚焦电泳结束后 （＋） （＋） （－） （－） 高pH 高pH 低pH 低pH C. 双向电泳 第一向：等电聚焦电泳第二向：SDS双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图： 水平方向反映出蛋白在pI上的差异， 垂直方向反映出它们在分子量上的差别。 第一向电泳：等电聚焦电泳 聚焦后凝胶放置在SDS凝胶上，进行第二向电泳 第二向电泳：SDS分子量大 分子量小 pH9 pH3 pH9 pH3 大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片 等电聚焦电泳进行过程中 等电聚焦电泳结束后 （＋） （＋） （－） （－） 高pH 高pH 低pH 低pH 组织匀浆 硫酸铵分级 离子交换 凝胶过滤 亲和层析 一种目的蛋白经五个纯化步骤（分别取样）的凝胶电泳图 1.5 蛋白质的氨基酸序列确定 每一种蛋白质都具有唯一的氨基酸序列。实际上蛋白质的氨基酸序列是由DNA决定的。 一级结构 二级结构 三级结构 四级结构 A. 蛋白质的氨基酸组成的定量确定 酸水解：破坏蛋白质的肽键 柱层析：进行氨基酸定量分析，每个氨基酸的量与洗脱峰 的面积成比例。 B. Edman降解方法常用于氨基酸序列的测定 第一轮降解 第二轮降解 PTH－丙氨酸 少了一个氨基酸残基的肽 见P168和176 C. 大蛋白被水解成肽段后再测序 Edman降解法测序一次只能连续降解几十个氨基酸残基。要测定大的蛋白质的氨基酸序列，需要将蛋白质降解为一些肽段，然后再进行Edman降解测序。 溴化氰（BrCN）：可以特异与蛋白质中的蛋氨酸残基反应 生成一个C末端为高丝氨酸内酯的肽和一个带有新的N 末端残基的肽。 胰蛋白酶：特异地催化赖氨酸（Lys）残基和精氨酸（Arg） 残基羧基侧的肽键的水解， 胰凝乳蛋白酶：特异地催化苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸 （Tyr）和色氨酸（Trp）三种芳香族氨基酸残基羧基一 侧的肽键水解。 *