蛋白质组学-LDH选读.ppt

主要质谱类型 MALDI-TOF MS: 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱 (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) ESI MS: 电喷雾质谱（ electrospray ionisation mass spectrometry ） MALDI 利用固体基质分子均匀包埋样品分子，在激光照射下，基质分子吸收激光能量而蒸发，携带样品分子进入气相，进一步将能量传递给样品分子，从而实现样品分子离子化。 MALDI 最大的特点是离子电荷通常为1-2个，而不象ESI中为多电荷离子，对分子质量较大的样品而言，不会形成复杂的多电荷图谱，因而对图谱的解析比较清楚。 ESI 待测分子溶解在溶剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口。在高电压作用下形成带电荷的雾滴，随着雾滴中溶剂的蒸发，其表面电场随半径减少而增加，电荷密度不断变大，到达某一临界点时，样品以离子方式蒸发进入气相，从而实现离子化。 没有直接的外界能量作用于分子，因此对分子结构破坏较少，是一种典型的“软电离”方式。 可形成多电荷离子，因此在较小的m/z范围内可以检测到大分子质量的分子。采用电喷雾质谱目前可测定分子质 量100 kDa以下的蛋白质，最高可达150 kDa。 由于采用液相方式进样，可与蛋白质化学中常用的液相色谱联用，即液相色谱-电喷雾质谱 (LC-ESI MS)。 在常规电喷雾质谱中，喷雾的过程易形成较大液滴，液 滴中的样品分子在离子源就不能完全离子化，从而降低 了样品的利用率和灵敏度。 电喷雾源(ESI)的特点 鉴定与注释蛋白质的路线 通过肽指纹图谱（peptide mass fingerprint, PMF）和数据库搜寻匹配 通过检测样品中部分肽段的二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配 MALDI-TOF/TOF LC-MS/MS PMF +TOF MS: 180 MCA scans from Serum T 040703.wiff Max. 201.0 counts. 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 0 10 20 30 40 50 60 70 80 95 Intensity, counts 1465.6373 1206.5765 1913.9160 1503.6072 1434.5226 2178.9336 1552.6042 1169.5336 1951.8651 MS-MS 1205 MS-MS 1465 MS-MS 1913 蛋白质数据库 目前应用最普遍的数据库是NRDB 和dbEST 数据库。 NRDB 由SWISS-PROT 和GENPETP 等几个数据库组成；dbEST是由美国国家生物技术信息中心（NCBI）和 欧洲生物信息学研究所(EBI)共同编辑，包括大量肽序列标签（PST）。 SWISS-PROT () 拥有目前世界上最大的蛋白质组学数据库。 PMF或二级质谱匹配检索常用搜索引擎MASCOT () 3.3 蛋白质组学研究平台 抗体芯片 可用于研究在不同生理状态或病理状态下蛋白水平的量变。 优点：微型化，集成化，高通量化。 如肿瘤标志物抗体芯片等 内源标准化处理 常用荧光标记：Cy5和Cy3等。 酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system） 典型的真核转录因子都含有二个结构域: DNA结合结构域（DNA binding domain，DNA-BD）和 转录激活结构域（activation domain，AD） 。 二个结构域功能上相互独立又互相依赖，只有结合才具完整活性。 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。 利用酵母双杂交技术筛选新的相互作用蛋白： DNA-BD + Bait protein AD + cDNA文库的基因 将阳性反应的酵母菌株中的 AD-LIBRARY 载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析，研究与已知基因在生物学功能上的联系。 * * 蛋白质组学Proteomics 刘丹慧 温州医学院检验医学与生命科学学院 蛋白质是一种复杂的有机生物大分子，它们是生命活动的实际执行者。 几乎所有的生物催化剂--酶，都是蛋白质。构成细胞骨架和动物大部分结构的纤维物质也是蛋白质；胶原蛋白和角蛋白组成了皮肤，毛发和软骨；肌肉大部分也是由蛋白质组成。 蛋白质由一个一个的氨基酸首尾相接形成肽链，肽链再折叠形成一定空间结构。 前言与背景 10