lncRNA研究策略之RNAPullDown实验技术.doc

【实验技巧】lncRNA研究策略之：RNA Pull Down实验技术 lncRNA研究策略之：RNA Pull Down实验技术 RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。RNA pull-down使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过Western Blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。 1) lncRNA筛选： 通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析； 通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA的靶基因； 通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。 2) lncRNA确定： 通过5' RACE获取lncRNA 5'全长，3' RACE获取lncRNA3'全长，最终拿到完整的lncRNA序列。 3) 表达分析： 细胞水平表达：在细胞水平进行检测表达差异。 组织分布：检测不同组织、不同阶段表达特性。 表达水平动力学变化：比较不同处理条件下，如药物处理、诱导处理下，表达水平差异。 4) 功能研究： 功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体:原则上是将全长lncRNA定向克隆到表达载体上实现lncRNA的过表达。然而有些lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视lncRNA在基因组上的定位采取不同的研究策略。 功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达的影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响； 采用RNA pull down、RNA-RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation)、ChIRP-seq(Chromatin Isolation by RNA Purification)等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。 采用lncRNA芯片分析技术结合mRNA对lncRNA功能进行预测，研究lncRNA trans和cis作用机制。 采用配体指数级富集系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，设计一种RNA配体，与癌症相关的lincRNA结合达到抑制肿瘤细胞的生长和转移。 采用快速预测RNA与蛋白质相互作用与结构域（catRAPID）在线算法来预测RNA与蛋白质的相互作用，该算法根据RNA和蛋白质的二级结构、氢键和分子作用力来评估它们之间的相互作用的倾向。 采用非编码RNA沉默和定位分析（c-KLAN）技术对lncRNA进行功能缺失（Loss-of-function）研究和细胞定位，该技术是在基于核糖核酸内切酶制备的小干扰RNA（esiRNA）和荧光原位杂交（FISH）2种现有的研究方法的基础上建立起来的。 5) 表达调控：将lncRNA表达与其他领域相结合，解释lncRNA调控机理。 DNA甲基化：可通过检测相应基因甲基化差异与lncRNA结合分析。 转录因子：研究lncRNA与转录因子的调控机制。 染色质重塑：lncRNA表观调控。 一.质粒转化、涂板、摇菌 1.取JM109感受态细菌80μl，加入1.5mlEP管中，用10μl枪头沾取质粒加入上述EP管中，混匀。 2.冰上静置30min。 3.42℃热休克90-120s。 4.迅速移至冰上静置2min。 5.在超净台内，于上述EP管中加入50μlLB培养基（Amp－），37℃，160rpm摇床，增菌0.5-1h。 6.菌液4,000rpm离心10min，弃大部分上清，将沉淀重悬，菌液全部加入LB平板（Amp+）上，涂布均匀，37℃倒置培养（过夜12-15h）。 7.将37℃培养（12-16h）平板取出，于无菌操作台中挑取单克隆放入内含5mlLB培养基（Amp+）的15ml离心管中，于37℃、250rpm摇床增菌过夜18H,看菌液是否浑浊。菌液浑浊后进行质粒中提。 二.质粒中提（TIANGEN，DP107-02） 1.柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。 2.取1.5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。 3.向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1使用移液器彻底细菌沉淀。 4.向离心管中加入250μ