改进植物油黄曲霉毒素B1测定的前处理方法.docVIP

改进植物油黄曲霉毒素B1测定的前处理方法 　　【摘 要】黄曲霉毒素B1在自然界广泛存在，具有强烈的致癌性，其是黄色曲霉菌（Aspergillus flavus）或寄生曲霉菌（Aspergillus parasiticus）的主要次生代谢产物，是目前已知的自然物质中致癌性最强的一种。黄曲霉毒素B1毒性剧烈，致癌性强，即使含量非常少，通过生物积累，也能引起人体器官癌变，所以国内外对其限量标准以及检验方法都做了严格和深入的研究，但是常用的检验前处理方法步骤繁琐，费时费人力，消耗大量的试剂，且灵敏度低。通过尝试利用恒温振荡器和特制的塑料振荡架进行植物油的前处理，用酶联免疫方法对样品中黄曲霉毒素B1进行检测，大大提高了检验速度、检出限，降低了成本，对于一般的样品可加提取液直接测定，具有很高的灵敏度。 　　【关键词】植物油 黄曲霉毒素B1 前处理黄曲霉毒素是一类真菌（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些和人类血液，动物饲料相关的产品中。其中黄曲霉毒素B1（AFB1）的毒性、致癌性、污染频率均居于首位。而使用黄曲霉毒素B1 ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样品中黄曲霉毒素B1残留。参考国家标GB/T5009.22-2003。黄曲霉毒素B1检测试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代真菌毒素检测产品，相比起薄层层析法操作时间短于60min，能最大限度地减少操作误差和工作强度，提高了试验灵敏度，且安全无污染。 　　1 试验材料与方法 　　1.1 主要材料 　　板式酶标仪；恒温孵育箱；梨形分液漏斗（250ml）；恒温振荡器；特制20孔振摇架，50ul-1000ul移液枪。 　　1.2 主要试剂 　　石油醚（分析纯，沸点60-90）；1+1甲醇水；ELISA定量检测试剂盒（苏菲内含AFB1抗原包被12孔x2条形戴康酶标板；抗原稀释液；抗原；样品稀释液；显色液ab；终止液；洗液；标准液。 　　1.3 操作步骤 　　1.3.1 前处理步骤 　　（1）梨形分液漏斗涂好凡士林，编号，称取5g左右样品于梨形分液漏斗中。 　　（2）分别加入20ml石油醚和25ml1+1甲醇水溶液。 　　（3）用适宜的胶塞紧塞梨形分液漏斗，按顺序倒立于特制的20孔振荡架（刚好可以固定梨形分液漏斗）中，再把振荡架嫁置于恒温振荡器上。 　　（4）打开恒温振荡器电源开关和振荡开关，调好左右摇晃的速度，振摇15分钟左右。 　　（5）取下分液漏斗胶塞，静置片刻后，扭到活塞，放下下层的甲醇水溶液于一次性杯内。 　　（6）用移液枪按样品顺序分别移取300ul样品液于10ml安培瓶内，再加入900ul样品稀释液于样品液内摇匀备用。 　　1.3.2 试剂盒处理步骤 　　（1）将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 　　（2）取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2～8℃，不要冷冻。 　　（3）洗涤工作液在使用前也需回温，且按20：1的配比配制洗液。 　　（4）编号：将样本和标准品对应微孔按序编号。 　　（5）加标准品/样本：在标准孔内加入从低到高浓度的标准液各50ul，再在样品孔加入样品液50ul后，再加入AFB1抗原试剂50ul/孔，轻轻振荡混匀，放置入恒温孵育箱内孵育30min。 　　（6）洗板：小心拿出反应板，将孔内液体用力甩干，吸取洗涤工作液250ul/孔，充分洗涤4次，每次间隔2分钟，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。 　　（7）显色：加入底物液A液50ull/孔，再加底物液B液50ul/孔，轻轻振荡混匀，再放置恒温孵育箱避光环境反应15～20min。 　　（8）终止反应：加入终止液50ul，摇匀。 　　（9）测定：设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。（若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定）。 　　2 结果与讨论 　　2.1 结果计算 　　以酶标仪测出的OD相对值为Y轴，输入酶标仪计算原件内，并编辑好稀释倍数以及标准曲线浓度，用对照标准曲线图，得出样品的AFB1的lgX值，求出X值，及为样品中AFB1含量。 　　2.2 结果验证 　　用液相色谱法处理同一样品，与本法得出的实验结果不大。 　　3 操作注意事项 　　（1）室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。 　　（2）在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。 　　（3）每