杜仲再生体系优化.docVIP

杜仲再生体系优化 　　摘要：对杜仲再生体系中不同途径愈伤组织的诱导、增殖、分化、茎段腋芽萌发、增殖、生根培养基激素组合进行了一系列优化试验。试验表明：叶片愈伤组织诱导的激素最佳组合及配比是NAA浓度为1.5mg/L，BA浓度为2.0mg/L，诱导率达94.4%；最佳增殖培养基的组合及配比是MS+NAA 1.0mg/L+BA 0.5mg/L等几组，诱导不定芽的培养基以MS+NAA 0.5mg/L+BA 2.0mg/L为宜，诱导率达83%；在附加NAA 0.2mg/L+BA1.0mg/L的MS基本培养基上外植体腋芽生长状况最佳，萌发率达98%；在附加1/4MS+IBA 2.0mg/L的茎段生根培养基上，生根率达43.3%。 　　关键词：杜仲；组织培养；优化 　　组织培养可为遗传育种工程提供理想的受体材料，又可为常规植物品种改良提供新的途径。杜仲树生长周期较长、树体高大、用于操作的群体数目相对较小，如果采用常规的方法进行改良育种很难操作。当前在杜仲组织培养方面已经有了很多研究成果，但出根和出芽率不高成为影响杜仲组织培养的主要原因。本试验以组织培养技术为基础，较为详细地研究了影响杜仲不同外植体愈伤组织的诱导、增殖和分化的因素，有效提高了其生根生芽率，目的在于为杜仲的组织培养和细胞培养提供参考依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　杜仲健康的单株幼嫩枝条（陕西省西北农林科技大学西林校区）和当年采集的成熟翅果。本试验使用的仪器主要有FA104型电子天平、超净操作台、高压灭菌锅等。采集当年生新鲜、健康无损的幼嫩叶片，先用流动的自来水彻底清洗并流水冲洗5h，然后先用75%的酒精浸泡60s消毒、无菌水冲洗5～6次，再用0.1%的氯化汞浸泡7～8min，再用无菌蒸馏水冲洗5～6次后备用。 　　采集当年生新鲜、健康无损的嫩茎（剪除叶柄及叶片）切成4cm左右（带1个腋芽）的茎段，加入有10ml/L清洗剂水烧杯中洗涤浸泡10min后，置于烧杯中用流水冲洗2h，然后放入干净的容器中加入75%酒精摇动杀菌2min，再用蒸馏无菌水冲洗3～4次，用0.1%的氯化汞充分浸泡10min，再用无菌水冲洗4～5次后备用。 　　1.2培养基的制备及灭菌 　　采用MS培养基（30g/L蔗糖，以6g/L琼脂固化）。先在微波炉内中高火加热25min，使蔗糖和琼脂充分溶解，加热开始15min时，用玻璃棒搅拌使其能够充分溶解，取出后将pH值调至5.8，根据不同的培养目的，再加入不同种类和浓度的植物生长调节物质。趁热分装时不能沾到瓶口或内壁上，以防止后期出现污染。培养基分装后应立即用膜封口并进行高压灭菌。高压灭菌采用121℃，时间为20min。所用培养基瓶规格为50mL，分装用瓶25mL，封口只用单层封口膜。 　　工具的灭菌注意：将清洗干净晾干后的容器及接种工具，用牛皮纸包好用高压灭菌锅灭菌。注意在超净工作台接种操作时应用75%的酒精浸泡接种工具，并在酒精灯上反复灼烧灭菌。 　　配制溶液注意：（1）在配制大量元素以及微量元素母液时，为了防止产生沉淀，各种盐类必须在充分溶解后才能混合，混合时要注意先后次序。（2）铁盐类需单独配制。（3）生长调节物质可配成母液，但浓度不能太大。由于其不溶于水，配制时应根据种类不同用95%酒精或稀酸、稀碱液先溶解，再定容。（4）配好的各类母液贴上标签，在2～4℃的冰箱中储存。 　　1.3试验方法 　　进入接种室前应用紫外灭菌灯照射1h以上，严格按照操作程序操作，结束后做好标记，注明接种日期、名称等，立即拿到培养室定期观察，及时处理受污染的材料，观察生长情况并做好记录。 　　1.3.1以嫩叶为材料。（1）愈伤组织的诱导和增殖。把新鲜嫩叶切成0.5cm×0.5cm的方片，叶片正面朝上，置于附加植物生长调节物质的MS培养基上。NAP，的浓度依次为0.5、1.0、1.5、2.0mg/L，BA的浓度依次为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0mg/L（见表1）。每瓶接2～3块，每个处理约35瓶，置于24～26%，12h光照、12h黑暗条件下进行培养。一段时间后，挑选颜色嫩黄、生长旺盛的愈伤组织，切成大小一致的小片，接种于附加生长调节物质的培养基上，NAP，的浓度为0.5、1.0、1.5mg/L，BA的浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0mg/L（见表2）。每瓶接3～4片，每个处理接种60瓶，放置在25%，12h光照12h黑暗的培养室。（2）不定芽的诱导。将培养好的愈伤组织接人附加植物生长调节物质的培养基中，NAP，的浓度为0.5mg/L，BA的浓度为1.0、1.5、2.0、2.5mg/L（见表3），进行不定芽的诱导。每瓶接2～3块，每个处理约70块，置于25%，12h光照、12h黑暗条件下进行培养。 　　1.3.