毕赤酵母异源表达几丁质酶对大豆核盘菌的生防潜能分析.docVIP

毕赤酵母异源表达几丁质酶对大豆核盘菌的生防潜能分析 　　摘 要：将来自于棘孢木霉的几丁质酶基因整合到了毕赤酵母基因组中，并对表达产物进行了生防潜能分析。结果表明，pH值为6和温度为40 ℃时几丁质酶活性最高，表达产物能够显著抑制大豆核盘菌的生长，并通过诱导ROS积累和抗性酶活性提高大豆对核盘菌的抗性。 　　关键词：几丁质酶；异源表达；酶学特性；生防潜能 　　中图分类号：S476 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.11.002 　　Abstract： Chitinase from Trichoderma viride was expressed in Pichia pastoris， and the biocontrol potential was analyzed. The results showed that Chitinase had the highest activity when pH was 6 and temperature was 40 ℃. Furthermore， Chitinase significantly inhibited the growth of Sclerotinia sclerotiorum and improved the resistance to sclerotiorum by inducing ROS accumulation and the activity of resistant enzymes. 　　Key words： Chitinase； heterologous expression； biocontrol potential 　　大豆（Glycine max （L.） Merrill）是世界上重要的植物油和蛋白来源。核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary）引起的大豆菌核病是一种世界性的大豆病害，是影响大豆产量的第二大病害因素[1]。与化学防治相比，生物防治可以有效克服污染环境、危害人畜健康等缺点，并因此成为当前植物病害防治研究的热点之一。 　　木霉（Trichoderma spp.）是世界上公认的生防菌，抗真菌代谢物在木霉的生防功能中起着重要作用。几丁质酶就是一类重要的抗真菌代谢物，能够水解真菌细胞壁的主要成分几丁质[2-3]，从而抑制真菌的生长。已有研究表明，该基因的表达能够增强植物对多种病原菌的抗性。与非转基因植株相比，表达木霉几丁质酶的转基因烟草（Nicotiana tabacum）和土豆（Solanum tuberosum）对交链孢霉（Alternaria alternata）、茄链格孢（Alternaria solani）和灰葡萄孢菌（Btrytis cinerea）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）[4]，苹果（Malus pumila）对黑星病菌（Venturia inaequalis）[5]，柠檬（Citrus limon）对茎点霉（Phoma tracheiphila）和灰霉病菌（Botrytis cinerea）[6]的抗性都显著增强，表明几丁质酶对于增强植物的抗病性具有重要作用。笔者研究了毕赤酵母异源表达的棘孢木霉几丁质酶对大豆核盘菌的生防机制，为几丁质酶应用于植物病害防治提供理论依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材 料 　　PDA培养基：土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，pH 值6.0定容至1 L；几丁质酶基因（Tachi）来自于棘孢木霉（T. asperellum），酵母表达载体pPIC9K本实验室保存。 　　1.2 方 法 　　1.2.1 毕赤酵母表达载体构建 在棘孢木霉几丁质酶基因（Tachi）的CDS序列两端引入BamHI和KpnI酶切位点，进行PCR扩增并回收目的片段。采用BamHI和KpnI双酶切，将目的片段连入pPIC9K载体，获得pPIC9K-Tachi重组质粒，并对重组质粒进行PCR和双酶切检测。根据pPIC9K载体的多克隆位点和Tachi基因序列设计并合成以下引物序列：Chi1：5―ATCGGAATTCATGGTCCCTCAGTCTCGAGCC―3 EcoRI （划线部分为BamHI酶切位点）；Chi25―CGATGGTACCTTATTCGTCAAGCCCTCTCTT―3（划线部分为KpnI酶切位点）。 　　1.2.2 pH值和温度对几丁质酶活性的影响 在分析pH值和温度对几丁质酶活性的影响时，将酶液分别加入不同pH值（3，4，5，6，7，8，9）的磷酸缓冲液中，首先找出最适pH值，然后在最适pH值条件下，反应温度分别设定为20，30，40， 50，