兽医病毒学实习十一穿透式电子显微镜检查.docVIP

獸醫病毒學實習十: 穿透式電子顯微鏡檢查 (一)目的: 認識三大類電子顯微鏡:穿透式電子顯微鏡、掃描式電子顯微鏡、掃描穿透式電子顯微鏡。 了解電子顯微鏡的功用與放大倍率。 了解電子顯微鏡的操作方式。 學習PBS的配製與正確的電子天平使用方法。 了解如何製作樣本與所使用之化學藥劑的特性。 (二)材料與器具: 電子天平 秤藥紙 藥勺 手術刀 Eppendorff tube 組織蠟塊 鑷子 量筒 磁石 磁石攪拌器 燒杯 塑膠試管 NaCl 0.16g KCl 0.004g KHPO 0.01g NaHPO-12HO 0.0077g 加DDW到50 ml (三)步驟: 配製50 ml PBS 1.秤取0.16g NaCl加入塑膠試管秤取0.004g KCl加入塑膠試管秤取0.01g KHPO加入塑膠試管秤取0.077g NaHPO-12HO 加入塑膠試管將DDW加入塑膠試管中至約45ml左右。 2.輕輕搖晃使溶解後,倒入量筒中,加入DDW至50ml。 3.均勻。 4.將溶液倒回塑膠試管,蓋上蓋子。 固定 1.當80 % 細胞產生細胞病變(CPE)後，以細胞刮除用具將細胞刮除，細胞液置於15 mL 離心管內，使用低溫離心機，以18 ×g (3,000 rpm) 離心3 分鐘後取沈澱之細胞團塊。 2.在室溫陰暗處以2 %戊二醛(glutaraldehyde；GA)溶於0.1 M 磷酸緩衝液(phosphate buffer, pH6.8-7.4) 固定2-4 小時，之後以0.1 M 磷酸緩衝液清洗3 次，每次10 分鐘。(戊二醛(glutaraldehyde) 怕光怕熱，一定要放冰箱，現用現泡，一般使用2-4 %，超過8 % 細胞會變形。由於GA固定能力太強會破壞蛋白質，因此做免疫螢光染色只能用paraformaldehyde。 3.細胞團塊在4 °C 陰暗處以1 % 鋨酸(osmium tetroxide；OsO4) 後固定2-4 小時，之後以0.1M 磷酸緩衝液清洗3 次，每次10 分鐘。細胞團塊在4 °C 陰暗處以1 % 鋨酸(osmiumtetroxide；OsO4) 後固定2-4 小時，之後以0.1M 磷酸緩衝液清洗3 次，每次10 分鐘。(鋨酸(osmium tetroxide；OsO4)，怕光怕熱，要放入褐色瓶，易蒸發且毒性高，有神經毒，需戴口罩和手套，作用後標本顏色愈黑愈好，操作一定要在抽氣櫃中，OsO4對組織親和性很高。) 脫水 進行脫水前先將細胞團塊細切成1 mm3；在室溫下以一系列濃度50%、70%、85% 及95%乙醇進行脫水各20 分鐘，再以100 % 乙醇脫水2 次，每次30 分鐘。 在4 °C 下以等比例100 % 乙醇及LR white 樹脂滲透24 小時，再以100 % LR white樹脂包埋2 次，每次24 小時；在60 °C 下聚合反應26小時。 以超薄切片機製作80 nm 超薄切片，置於 200 格銅網上(由於電子的穿透能力極低，樣品的厚度必須在50 到100 nm 間，並以超薄切片機切片才能在電子顯微鏡下觀察) 。 以2 % 醋酸鈾(uranyl acetate) 染色30 分鐘，用一次蒸餾水清洗。再用1 % 檸檬酸鉛(lead citrate) 染色15 分鐘，以一次蒸餾水清洗；最後以穿透式電子顯微鏡進行檢查。 染色 將病毒液及介面活性劑(0.1％ Bacitracin) 各滴一滴於parafilm 上。 以抗毛細現象之夾子夾住一片鍍有炭及膠膜之銅網片(grid)，網面沾上介面活性劑，使病毒易附著。 再將grid 於病毒液上，靜置5分鐘。 4.滴一滴2 % 醋酸鈾(uranyl acetate) 於parafilm上。 5.再將含病毒之grid染色30秒。 6.以濾紙吸去過多之液体，乾燥後即可進行穿透式電子顯微鏡檢察。 (四) 補充資料: 穿透式電子顯微鏡 穿透式電子顯微鏡(Transmission electron microscope)，是把經加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產生立體角散射。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關，因此可以形成明暗不同的影像，影像將在放大、聚焦後在成像器件上顯示出來。由於電子的波長較短，透射電子顯微鏡的解析度比光學顯微鏡高很多，可以達到0.1～0.2nm。因此，使用穿透式電子顯微鏡可以用於觀察樣品的精細結構，比光學顯微鏡所能夠觀察到的最小的結構小數萬倍。TEM在中和物理學和生物學相關的許多科學領域都是重要的分析方法。在放大倍數較低的時候，TEM成像的對比度主要是由於不同材料的厚度和成分造成對電子的吸收不同而造成的。