waters_e2695_training概要.ppt

HPLC 基础知识简介 HPLC 基础知识简介 HPLC 基础知识简介 HPLC 基础知识简介 HPLC 基础知识简介 HPLC 基础知识简介 容量因子k 分离因子α HPLC 基础知识简介 k‘， α和N，如何控制？ Waters软件操作 4、单次进样和样品组进样 5、3D数据处理 6、打印报告 1、流动相及溶剂瓶 流动相脱气不充分易引起噪声大，出现毛刺峰。溶剂过滤器堵塞会引起流动相供给不畅，压力不稳。流动相被污染了会引起基线上升，梯度洗脱出现鬼峰。 2、初始化错误：Plunger homing over pressure-在线过滤器堵塞。 3、泵常见故障：Lost Prime-单向阀堵死。 4、进样器故障：需使用匹配的进样瓶，易出现进样针堵塞，空白溶剂出现色谱峰时，需加倍清洗或者调整样品浓度顺序（L-H）。 5、色谱柱故障： 6、检测器故障：灯故障易引起噪声大，灵敏度下降。流动相和样品脏易引起流通池污染和堵塞故障。 7、堵-压力高 柱压升高，升高的依据应该跟之前相同条件下所得的柱压进行对比。 堵应该先排除是系统堵还是柱子堵，首先断开色谱柱，连接两通，如果压力超过1500psi，那么系统肯定是堵了，滞后逐一排查，清洗或者更换被堵部件。 Notes:溶剂吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若被污染,应作清洗和钝化处理。一般采用30％磷酸水溶液作为清洗剂，用6M硝酸作为钝化剂，先清洗再钝化。清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢。钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜。 （清洗钝化步骤：设ABCD25% 1ml/min 水-30%磷酸or6M硝酸 45min-水至中性-甲醇） 色谱柱堵塞引起压力高，可能由于填料表面物质吸附或沉淀引起，则需对色谱柱进行清洗，建议方法低流速清洗。 反相色谱柱：水，甲醇，四氢呋喃，二氯甲烷, 甲醇 和水 正相色谱柱：二氯甲烷，四氢呋喃THF, 水,甲醇， 二氯甲烷。 如果还是不行，则可考虑反冲或者购买新柱。 1、色谱图保留时间变化问题 A）前后两针进样差异大：泵以及混合器问题。 B）同一实验条件，同一批实验保留时间一致，隔一短时间进样结果与之前相差较大：流动相组成问题。 配比误差：1%的误差，引起RT5~15%变化。一般按重量比配比比按体积比会更加准确一点 pH误差：0.1单位的改变，引起RT10%变化。 脱气方法：需最大程度减少流动相挥发。 温度的影响：色谱峰的保留时间变化方向一致，据经验，温度每变化1度，保留时间会有1%~2%的变化。 2、峰面积波动 同一时间多次进样波动：注射器内有气泡、流速不规律变化（泵和单向阀问题）、前伸峰和拖尾峰的积分方法问题、样品未完全洗脱（样品之间加一针空白样）等。 一般来说，峰面积的标准偏差在1%范围内可以接受，0.2~0.5%是非常好的。 Waters液相操作 2、系统平衡：跑基线 正确安装色谱柱后，用准备好的流动相平衡系统，大约0.5~1h. 3、样品准备：过滤，样品瓶中应有超过1//3高度 的样品量。 4、编制仪器方法，开始试验，软件操作。 5、清洗：实验结束后，应对液相系统（进样器、泵、检测器等）、色谱柱进行清洗。建议批量进样后，最后进一针50ul流动相，如果流动相中有盐，则用纯水代替缓冲盐那部分比例。清洗后色谱柱和系统中需填充需要的溶剂。 6、关机：退出Empower控制软件，依次关闭泵，检测器，电脑等电源。 Waters软件操作 1、登入 2、项目建立 3、方法编辑。Empower中所有功能都需要相应的“方法”去实现。 仪器方法：设置仪器参数采集样品 处理方法：对色谱数据进行处理计算 报告方法：对色谱结果打印报告 输出方法：输出色谱数据。 方法组：将上述方法组合，从而可以进行数据的批处理。 常见仪器故障-Troubleshooting 常见仪器故障-Troubleshooting 常见仪器故障-Troubleshooting 常见仪器故障-Troubleshooting 常见色谱图故障-Troubleshooting 常见色谱图-Troubleshooting * --中心实验室 唐翠娥 Waters High Performance Liquid Chromatography（HPLC） Training 5 2 3 4 1 目 录 HPLC 基础知识简介 HPLC 系统组成部件 软件操作 Waters e2695实验操作 常见色仪器和色谱图故障 较广，非极性至中等极性的组分 溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物 适用范围 极性大先洗出 极性小先洗出 组分洗脱次序 中~高 低~中 流动相极性 中~低 高~低 固定相极性 反相色谱法 正