第3章微生物的基因操作(上)[兼容模式]解剖.pdf 88页

第二章. 微生物的基因操作技术 （（上上）） 第一节 基因操作的主要技术 原理 1． 核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide) ? 将某种分子放到特定的电场中，它就会以 一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场 作用下的迁移速度叫作作用下的迁移速度叫作电泳的速率电泳的速率，，它与电场它与电场 强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正 比，而与分子的磨擦系数成反比 （分子大小、 极性、介质的粘度系数等）。 ? 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是 离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚 阴离子状态 （Polyanions ）。将DNA、RNA放 到电场中，它就会由负极→正极移动。 ? 在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭 （EB ）--ethidium bromide染色，此时，核 酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到 约50ng DNA所形成的条带。 ?? DNADNA 的脉冲电场电泳技术的脉冲电场电泳技术 :PFGE:PFGE-- Pulse-field gel electrophoresis 2 ．核酸的分子杂交技术 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶 电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交 之前，通过毛细管作用或电导作用按其在 凝胶中的位置原封不动地 “吸印”转移到 滤膜上的滤膜上的。。 常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素 滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸 （DBM ） 和二乙氨基乙基纤维素滤膜 （DEAE ） 3 ．细菌的转化 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获 了来自另一种细菌菌株的DNA ，而导致性状特征 发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA 的 菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA 的寄主菌株 则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验 菌株。在加入转化DNADNA之前，必须预先用CaClCaCl22 处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态 （Competent Cells ）。Mg2+对维持外源DNA 的稳定性起重要作 用，质粒DNA 中的抗生素是筛选标记。 4 ．DNA序列分析 a. Sanger的双脱氧链终止法 Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱 氧链终止法测定单链DNA 的序列，其基本原理如 下： ①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确 的DNA互补链；DNA聚合酶常用Klenow大片段， 无5'→3'外切酶活性。 ②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将 其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其 延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA ， 引物 （特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA 聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种 ddNTP 。 b ．DNA序列分析自 动化(分析反应\读 片过程 ) 用四甲基若丹明 (Tetramethylrhoda mine)作为荧光剂 标记DNA 引物，带 有这种引物的DNADNA 片段能在激光诱导 下发出荧光。按照 标准的双脱氧终止 法或化学终止法进 行测序反应，跑 DNA凝胶后,用计 算机检测。 DNA测序的全过程(实际) ．基因的定点诱变 （site-directed mutagenesis ） 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个 特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过 程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋 白质工程的重要手段。 如： 盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括盒 式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。 6． 利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.