AcNPV对棉铃虫的感染试验.pdfVIP

AcNPV对棉铃虫的感染试验- 何丽华 翁宏飚牛宝龙沈卫锋孟智启术 (浙江省农业科学院蚕桑研究所，杭州310021) 摘 NPV液，在幼虫期或蛹期都能感染发病，且随着AcNPV病毒浓度的增加死亡率也提高；镜检 死亡幼虫或死亡蛹都可见AcNPV病毒多角体。设计AeNPV特异引物，对试验区存活的棉铃虫 成虫进行PCR检测，收集阳性个体的后代幼虫，饲养后进行PCR检i贝JJAcNPV，结果均为阴性， 初步试验表明AcNPV病毒能感染棉铃虫幼虫、蛹及成虫，但并不能垂直传播。 关键词：AcNPV多角体；棉铃虫；穿刺接种 califomicaNuclear Virus，AcN— 野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa Polyhedrosis Pv)是一种昆虫杆状病毒，是目前最主要的昆虫杆状病毒表达系统之一，能交叉感染包括甜菜夜蛾 陬德昌松毛虫[21等30多种鳞翅目害虫[31，从棉铃虫血淋巴细胞培育的细胞系对AcNPV同样易感【4】。 为探讨AcNPV是否能在棉铃虫中垂直传播，本课题组采取对棉铃虫幼虫直接注射AcNPV液的手段， 后代是否有AcNPV。现将试验结果总结如下： 1．材料与方法 1．1供试虫种 为本室人工饲料饲养的棉铃虫，饲养到4—5龄或化蛹前2—3天备用。 1．2供试病原 档目的浓度即可。 1．3其它 微量注射器、漂粉精、甲醛、灭菌水、饲养用具等。 1．4PCR检测方法 根据AcNPV基因设计了一对特异性引物同。 7GGGGTCGAGGGTAGC CAC3’，AcNPVR序列为5 PCR方法进行检测。 1．5试验方法 1．5．1AcNPV对棉铃虫的感染及形态观察 个重复，每个重复100头棉铃虫，用微量注射器分别吸取上述两种浓度的病原液穿刺接种，每头注 ，浙江省“十五”重点科技攻关资助项目(021106600) ★通讯作者E—mail：mengzq@zaas．org 作者简介：何丽华(1968一)，女，浙江诸暨人，助理研究员，主要从事家蚕病理和昆虫分子生物学的研究。 一37— 射2-4uL，然后常规饲养。以穿刺灭菌水和空白作对照，试验过程中仔细观察记录棉铃虫的生长发 育情况，调查棉铃虫的幼虫死亡率和至蛹期死亡率。取一滴患病虫体或蛹体内的组织液于载玻片 上，加适量灭菌水后盖上盖玻片在显微镜下观察多角体的形状。 1．5．2AcNPV对棉铃虫当代的生命力影响试验 取大龄化蛹前2—3天的棉铃虫，用微量注射器分别吸取上述病原稀释液和灭菌水穿刺接种．每个区 设二个重复，每个重复100头棉铃虫，每头注射2—4uL，以空白作为对照，穿刺接种后常规人工饲 养。每天观察虫体变化情况，记录死亡幼虫数；化蛹后观察蛹期变化情况，记录死亡蛹数．同时镜 检观察幼虫、蛹体内是否有AcNPV病毒多角体。调查幼虫死亡率、蛹期死亡率、化蛹率和化蛾率 等。 1，5．3AcNPV对棉铃虫后代生命力和垂直传播试验 将上述六种病原液处理区存活的棉铃虫化蛹后进行蛹期保护，并将棉铃虫蛹用0．3％漂粉精液消 毒5分钟。待羽化后将成虫单蛾配对，卵布用2％甲醛溶液消毒5分钟，然后用去离子水漂洗。卵孵 化后收集幼虫饲养，调查幼虫死亡率，对死亡的幼虫进行镜检观察虫体内是否有AcNPV病毒多角 体，并提取成虫、幼虫的DNA后用常规的PCR方法进行检测。 2．结果与分析 2．1 AcNPV对棉铃虫的感染及形态观察结果 穿刺病毒液的棉铃虫表现出发病症状，虫体肿胀发白，大约4—6天棉铃虫发病死亡，死亡幼虫体表 一碰就破，镜检死亡幼虫和尚存活的幼虫可见大量AcNPV多角体。说明AcNPV能在棉铃虫体内增 水和空白对照区死亡幼虫镜检体内未见AcNPV多角体。AcNPV多角体感染棉铃虫后，在幼虫体内和 蛹体内大量复制增殖，形状多数为四角形，少数为五角形和六角形，如图1、2所示。棉铃虫的发病 死亡率如表1所示。 Ittl棉铃虫AcNPv多角体，400x m2棉铃虫AcNPV多角体，1000× 2．2 AcNPV对棉铃虫当代的生命力影响试验结果 虫．幼虫期和蛹期死亡率随AcNPV病毒液的浓度