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114 菌物学报 24卷 一个与双孢蘑菇耐热相关基因的全长cDNA序列 王泽生+ 陈美元 廖剑华 卢政辉 郭仲杰 李洪荣 (福建省轻工业研究所福州350005) 摘要：根据双孢蘑菇耐热相关基因片段028—1的cDNA序列设计并合成引物，应用cDNA末端快速扩增 (RACE)方法获得该基因的5’端cDNA片段，经测序和拼接后获得该基因的全长cDNA序列。该序列全长 1．37Kb．在GenBank中未发现明显的同源序列。 关■词：诱导培养DD—RTPCRRACEDNA克隆全长基因 双孢蘑菇[Agaricusbispoms(Lange)Sing．】是一种富有营养的、具有很高经济价值和重要生态意 义的栽培食用菌。它属于稳m(15—200C)结实性的菌类。温度是影响其生长的主要因素。为提高双孢 蘑菇的耐高温能力。发展其在自然气候条件下的周年生产，节省控温栽培的成本。我们拟通过基因 工程的手段选育耐高温的双孢蘑菇菌株。在前期研究中。我们用mRNA差异显示技术研究双孢蘑菇 常温培养及高温诱导培养条件下基因表达的差异，获得几个双孢蘑菇的耐热相关基因片段(王泽生 等，2003．2004)。 ofeDNA cDNA末端快速扩增技术(rapidamplificationends。RACE)，是基于PCR技术由已知的部分 cDNA序列从低丰度转录本中快速扩增cDNA 5’和3’末端简单而有效的方法．也称为锚定PCR(anchored PCR)和单边PCR(one—side PCR)(卢圣栋，1999)。由于通过mRNA差异显示技术获得的差异片段已经是 cDNA的3’末端序列，所以在本研究中。我们拟通过差异片段的已知序列设计引物。用RACE技术获得其 5’末端。以期得到该差异片段所在的耐热相关基因的全长cDNA序列。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1菌株：双孢蘑菇耐高温菌株02由福建省轻工业研究所蘑菇菌种研究推广站提供。大肠杆菌(E．coh) JMl09购自Pmmega公司。 1．1．2 RACEcDNA Vector 试剂：SMARTm Ampliiication Kit购自Clontech公司；pGEM—TEasy Systems 购自Promega公司；Trizol试剂、内切酶、PCR试剂盒及其它试剂均购自上海生工生物工程服务有限公司。 et 1．1．3引物：RACE所用的基因特异引物(GSPl)根据028—1片段序列(Chena1．．2002)及I认CE的技术要 CGCGAGTrCCAGACCACCCG 求设计并由上海生工公司合成，序列为：5’一AGGCC A一3’。其GC含量 为70％。Tm预测值为70℃。 1．2方法 1．2．1双孢蘑菇的常温培养：24℃条件下，用常规PD(马铃薯葡萄糖)液体培养基培养两周。 高温诱导培养：将常温培养后生长良好的液体培养物放人32℃培养箱中诱导培养12h。 122总RNA的提取：用Trlzol试剂一步法。按生工公司的试剂使用手册进行。 1．2．3总RNA的反转录：按SMARTrMRACEcDNA AmplificationⅪt使用手册进行。 1．2．4 RACEcDNA cDNA末端快速扩增(RACE)：按SMARITMAmplification晒t使用手册进行。 1．2．5 Vector RACE产物的克隆：按pGEM-TEasy Systems使用手册进行。 1．2．6DNA测序：PCR产物或克隆子交上海生工生物工程公司测序。 2结果与分析 2．1 总ltNA的提取及反转录 常温