（PBMC计数及活性检测）.ppt.ppt

设计性实验：常见细胞免疫检测I 生物病原及免疫学系 医学免疫学 实验三 实验内容 一、讨论： （一）免疫细胞的分离 免疫细胞的种类与特征 免疫细胞的分离技术 （二）表面标志检测技术 二、操作 （一）PBMC的分离 （二）PBMC的计数 三、示教： E-花环 * 免疫细胞的分离及检测 ※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定 ※方法：体外法为主 ※目的： 检测免疫细胞的数量和功能，观察机体免疫状态 免疫细胞的细胞生物学研究 免疫细胞的培养和建株 ※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效 免疫细胞的分离 将各种参与免疫反应的细胞从血液或组织中分离出来 一、讨论 细胞分离基本原理 不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同 免疫细胞分离、鉴定与计数 PBMC 多形核白细胞 红细胞 血浆 分离液 玻璃平皿 单核细胞吸附,未吸附的为淋巴细胞. 根据比重的不同将血液离心分层 取PBMC （一）外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells, PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞 （二）方法评价 是分离PBMC最常用的方法 操作简单，不需特殊仪器设备 分离纯度高，可达95％ 细胞得率高，可达80％ （三）淋巴细胞及其亚群的分离 尼龙毛分离法 E花环沉降法 免疫吸附分离法 磁珠分离法 流式细胞分选法 抗原肽-MHC分子四聚体技术 1、尼龙棉分离法 2、E花环分离法 T E花环 原理 B细胞可粘附尼龙毛； T细胞不具有粘附活性。 尼龙棉装入5ml注射器中 加入淋巴细胞悬液 37℃、 5％ CO2、1－2h RPMI 1640完全培养基灌洗 洗脱液中为T细胞 3、免疫吸附分离法 4、磁珠分离法 特点: 简便, 快速, 费用低, 无需特殊设备 流式细胞仪（FCM）优势:高速、 高纯度、高精度 激活细胞分类仪：用来分析、鉴定细胞的流式细胞仪。 Fluorescence activated cell sorter （FACS） 5、流式法 流式细胞分析 6、抗原肽-MHC四聚体分离技术 （四）免疫细胞的计数 1.单个核细胞的计数 2. T细胞检测 直接、间接免疫荧光法： 免疫组织化学法 微量细胞毒试验 3. B细胞检测 膜表面免疫球蛋白（mIg）检测 间接免疫荧光法　 免疫细胞表面标志的检测方法 流式细胞分析法 免疫细胞化学法 免疫荧光法 淋巴细胞表面标志检测的临床意义 淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。 对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。 免疫细胞表面标志检测及应用 淋巴细胞分离计数及活性 【实验任务】 市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用，请设计一个方案证实之（从淋巴细胞数目及活性的角度考虑）。 【目的要求】 初步掌握从淋巴细胞数目及活性的角度证实某产品有免疫增强作用的实验设计 掌握用密度梯度离心的方法分离外周血淋巴细胞 了解分离外周血淋巴细胞主要方法 了解外周血淋巴细胞的计数方法 实验动物（Balb/c或者其它品系小鼠） 注射器、针头、10ml离心管、滴管、吸管乳胶头、试管、试管架、离心机、天秤等。 待检测产品、植物多糖（如香菇多糖，是免疫增强剂作为阳性对照）、环磷酰胺（免疫抑制剂）、淋巴细胞分离液(聚蔗糖一泛影葡胺)，肝素，PBS液、。 其它：常规实验试剂、仪器等。 【试剂和材料】 实验方案 二、操作：密度梯度离心法分离人PBMC PBMC与血液中的其它成分存在密度差异， 利用密度在1.077±0.001g/L之间而且近于等渗的淋巴细胞分层液作密度梯度离心时，各种血液成分按密度梯度重新分布聚集， 血浆和血小板密度较低，故悬浮于分层液上部， 红细胞和粒细胞密度较大，故沉于分层液底部， PBMC密度稍低于分层液，故位于分层液层面上，这样就可以获得PBMC。 原理： 外周血 红细胞 粒细胞 单个核细胞 血小板 淋巴细胞 单核细胞 1.093 1.030~1.035 1.075 Ficoll：1.077±0.001 (PBMC) 1.092 2000rpm 25℃ , 20min PBMC 红细胞粒细胞 Ficoll 稀释外周血 Ficoll 稀释的血浆、血小板 用PBS液洗、离心 (1500rpm，5min) 细胞计数板  细胞计数 数上不数下，数左不数右。 计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数 活细胞百分率 = 活细胞数 细胞总数 × 100% 细胞活力检测：（死细胞被台盼蓝染成蓝色，活细胞不着色） * 象限quadrant * ppa *