基于电化学方法制备DNA芯片的研究.pdfVIP

基于电化学方法制备DNA芯片的研究 江丽萍6，昱篮茎“，朱洁文6，陈海宝‘，赵建龙。，章宗穰‘ (a．上海师范大学生命与环境科学学院化学系，上海市桂林路]00号，200234) (b中科院上海有机化学研究所上海200032) (c上海微系统与信息技术研究所上海200050) 自90年代初期生物芯片(Biochip)诞生以来，目前已经在功能基因组研究、疾病检 测等领域得到了应用。长链的DNA探针的共价键合固定一直是个难题，对其进行功能基 团的直接衍生比较困难，而将其共价固定又因表面反应产率低而难于进行。然而，导电 商分子聚合膜与基体电极的接触较为牢固，有利于固定DNA探针”1，提高了电极的稳定性。 此外，由于大部分导电聚合物的性质温和，不会导致生物分子的失活。另，将电化学方 法聚合导电高分子膜技术应用于生物芯片的制作，具有步骤简单，便于操作等优势。聚 毗咯作为一种制备生物传感器的优良材料，也有人报道了一个N一取代的吡咯一DNA衍生物 和毗咯共聚合制各的DNA模型芯片“。。 电聚合制备DNA芯片(DNAchip)有一些特殊的优越性，如定位和固定都由普通的 电化学装置控制即可完成，不需要价格高昂的光刻机或机械手。同时，随着微电子工艺 的进展，微电极制各技术的提高，芯片的集成度可得以提高。另一方面，DNA芯片是建立 在与互补DNA链形成双螺旋的基础之上的，杂交信号的检测方法通常利用同位索放射白 显影，或进行荧光标记。由于这类方法对基底材料的要求较高，操作过程也比较烦琐、 复杂，成本高。所以．人们越来越多地把目光投向了非标记浊检测DNA的杂交。近年在 DNA传感器方面的进展”1也给这一可能性提供了支持。因此，电化学方法是有前景的DNA 固定和检测方法。 本论文旨在探索利用电化学聚合的方法实现寡核苷酸分子的固定化，重点探索最佳 的电聚合条件，并尝试利用电化学的方法，即无标记法进行杂交检测。 从理论上讲3一取代吡咯化合物的聚合效率比N一取代高两剑三个数量级，因此可以预 计3一取代吡咯一DNA缀合物的应用将可能极大改变聚吡咯DNA芯片的表面状况。 此外，还根据电化学聚合的要求设计了比较理想的3一取代吡咯衍生物即DNA载体的 结构。 实验，扣以亲水性寡聚乙二醇链作为连接臂，设计并台成了3一吡咯甲基一四聚乙二醇单醚的 DNA投体。圆为使用亲水性连接臂一寡聚乙二醇，对后续的杂交过程永1检测都是有益的。 Shchepinov等人认为“。，固定的寡核苷酸探针距离固体表面在大约40个原子的距离 时对杂交效率最佳，在连接臂上引入正电荷或负电荷都对杂交不利。Guo等人”1用 oligo—dT(脱氧胸腺嘧啶)作为间隔臂，能够使杂交效率增加20倍。本实验则用四到六聚 的乙二醇构成连接臂的主体。为了满足杂交对空问的需要．再在寡核苷酸的5’端连接一 定【，度的01igo—dY。 m于核酸的空间位阻比较夫，为了保证其能按垂直于电橄的方向固定_【去，可通过 19 和其他毗咯化合物或者吡咯单体的共聚合来实现。实验中采用约2800：1的摩尔比例加入 oC下保温反应1小时， 对甲苯磺酰基保护的3一取代吡咯衍生物与3一取代吡咯一DNA，于80 mmol／L，3-取代吡咯一DNA终 取出后用lmol／LKCI溶液稀释至3一取代吡咯终浓度为40 浓度为14 mol／L，最终的聚合液中3一取代吡咯衍生物与3一取代吡咯一DNA之比为 2857：1。插入三电极体系(研究电极为=2mm的铂金圆盘微电极)，在M273恒电位仪 (EG＆GPARC，M270计算机操作软件)上应用循环伏安法进行电聚合。 亚甲基蓝(佃)是一种常用的生物染料，由于其可以嵌入DNA双螺旋的碱基对之间， 即当它嵌入到DNA双链中时，电子会沿着堆积的碱基对传递到远处。利用这一性质，可 将MB用作电化学检测杂交后的DNA双链的指示剂。 mmol／L 将DNA修饰电极置于含互补DNA链(220ng／1)的磷酸缓冲溶液(pH=7