第四章补充—沉淀分离与结晶探究.ppt

沉淀分离与结晶 蛋白质盐析 向蛋白质溶液中加入一定浓度的无机盐[(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做盐析。这样析出的蛋白质仍可以溶解在水中，而不影响原来蛋白质的性质。因此，盐析是一个可逆的过程。利用这个性质，可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质。 蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。 蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。 由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。 盐析法简单方便，可用于蛋白质抗原的粗提、丙种球蛋白的提取、蛋白质的浓缩等。盐析法提纯的抗原浓度不高，只用于抗原的初步纯化。 (六) 盐的饱和度 不同蛋白质的盐析要求的盐的饱和度不一样； 分段盐析法。 蛋白质等电点沉淀 在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等电点时的许多物理性质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从而有利于悬浮液的过滤。 结晶的方法一般有2种：一种是蒸发溶剂法，它适用于温度对溶解度影响不大的物质。沿海地区“晒盐”就是利用的这种方法。另一种是冷却热饱和溶液法。此法适用于温度升高，溶解度也增加的物质。如北方地区的盐湖，夏天温度高，湖面上无晶体出现；每到冬季，气温降低，石碱(Na2CO3·10H2O)、芒硝(Na2SO4· 10H2O)等物质就从盐湖里析出来。在实验室里为获得较大的完整晶体，常使用缓慢降低温度，减慢结晶速率的方法。 晶体在一定条件下所形成的特定晶形，称为晶习。向溶液添加或自溶液中除去某种物质(称为晶习改变剂)可以改变晶习，使所得晶体具有另一种形状。这对工业结晶有一定的意义。晶习改变剂通常是一些表面活性物质以及金属或非金属离子。 晶核生成（成核）和晶体生长两个阶段，两个阶段的推动力都是溶液的过饱和度（溶液中溶质的浓度超过其饱和溶解度之值）。晶核的生成有三种形式：即初级均相成核、初级非均相成核及二次成核。在高过饱和度下，溶液自发地生成晶核的过程，称为初级均相成核；溶液在外来物（如大气中的微尘）的诱导下生成晶核的过程，称为初级非均相成核；而在含有溶质晶体的溶液中的成核过程，称为二次成核。二次成核也属于非均相成核过程，它是在晶体之间或晶体与其他固体（器壁、搅拌器等）碰撞时所产生的微小晶粒的诱导下发生的。 （六）样品浓度 浓度小时，增加溶剂投入量和损耗。 浓度大时，增加共沉作用，降低分辨率。 蛋白质浓度0.5%～2%； 粘多糖浓度1%～2%。 * 第三节 其它沉淀方法 一、等电点沉淀法 对于两性物质，等电点时净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，发生沉淀。 * 胰岛素纯化： 胰岛素 pH8 除去碱性杂蛋白 pH3 除去酸性杂蛋白 * 金属离子沉淀：与生物分子的酸性功能团作用的金属复合盐法； 有机酸沉淀:与生物分子的碱性功能团作用的有机酸复合盐法（如苦味酸盐、苦酮酸盐、单宁酸盐等）。 * 二、成盐沉淀法 1．金属离子沉淀： Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等； 2．生成有机酸类复合盐沉淀 （1）单宁即鞣酸 （2）雷凡诺 （3）三氯乙酸（TCA） * 雷凡诺 * 猪心提取液 洗脱液 上清液 上清 细胞色素C 沉淀（去除） * 吸附 人造沸石 盐析 45%饱和硫酸铵 沉淀 TCA 透析 三、亲和沉淀 利用亲和反应原理，将配基与可溶性的载体偶联后形成