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第11章 基因工程和基因组学
第一节 基因工程
基因工程概念:
广义:包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程等
狭义:基因工程
一、基因工程概述
20世纪70年代初,DNA重组技术的发展而产生
1971, 美国Smith, H. O.
细菌 限制性酶,酶切病毒DNA分子——DNA重组时代的开始
1972, Berg, P.
猿猴病毒DNA
λ噬菌体 DNA
1973,Cohen, S
酶切后的外源DNA分子 + 质粒
诞生:
分离
限制性酶
新的DNA分子
重组DNA分子
1982,美国食品既药物管理局批准,
首例基因工程产品进入市场——细菌中表达人胰岛素
1985,转基因植物获得成功
1996,克隆羊诞生
基因工程——
改造,创建生命形态;
生产药品、疫苗、牛奶和食品;
诊断和治疗遗传疾病;
成为当今人类社会日常生活的组成部分。
应用:
DNA重组
——创造自然界没有的DNA分子新组合
分子生物学、核酸化学、微生物遗传学的现代方法和手段——综合技术
包括:
1. 从细胞和组织中分离DNA
2. 识别特异DNA序列的限制性内切核酸酶酶切DNA分子,制备DNA
3. DNA片断 + 载体 重组DNA分子
4.重组DNA分子 宿主细胞 产生多个相同的拷贝,克隆clone
5.重组DNA分子 通过细胞分裂分配到子细胞中
6. 从宿主细胞中回收、纯化、分析克隆的重组DNA分子
7. 克隆的DNA能转录成mRNA、翻译蛋白质。能分离、鉴定基因产物
宿主细胞中自我复制
二、限制性内切核酸酶
基因工程的工具、基石
功能:
识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列,切断双链的DNA。
降解细菌中外来的DNA 分子,限制、阻止细菌的侵染。
已经分离出200多种限制性内切核酸酶,可分两类
每隔一段DNA 序列随机切割双链DNA分子(无序列特异性 )
准确识别双链DNA特异序列(基因工程中广泛应用)
双链中,识别的序列是对称的:回纹对称序列(palindrome)
双链DNA被切割后产生两个相同的单链粘性末端(stiky end)
EcoRⅠ
两种片断放在一起,适宜条件下,通过碱基互补——双链DNA分子(通过氢键)
DNA连接酶,形成磷酸二脂键,连接成重组的DNA分子
切割后产生平齐单链粘性末端
SmaⅠ
切割后产生平齐末端, DNA连接酶,连接成重组的DNA分子
酶切
重组的DNA分子
部分常用的限制性酶
作用:
经过酶切的DNA片断,只有和适合的载体(vecter)DNA连接构成重组DNA分子,通过载体进入宿主细胞( host cell ),在宿主细胞中复制、扩增、克隆出多个拷贝。
可作为DNA载体的有:
质粒、噬菌体、病毒、细菌、酵母人工染色体BAC、HAC等
三、载体
作为载体的DNA分子需具备的条件:
具有复制原点(ori),在宿主细胞中独立自我复制,携带的外源DNA片断一起复制。
多克隆位点(multiple cloning site,MCS或polylinker region),具有多种限制性酶切的切点,每种酶切的切点只有一个,切点不在复制原点、抗生素选择标记基因内。
有选择标记(至少一个),抗生素、某种酶,而宿主中没有这种基因
容易从宿主细胞中回收。
1. 细菌质粒
独立于细菌染色体而自然存在,自我复制、容易分离和导入,环状双链DNA分子。
用于克隆分子量 10 kb 的外源DNA 片断,应用范围广,拷贝数多。
1000个
1个
宿主细胞
宿主细胞
转化时
重组型检测标记
在DNA克隆中
根据宿主表型 质粒是否带外源DNA 片断
Puc18
分子量小(接受较大片断)、拷贝数多(500)、多克隆酶切位点(克隆方便)、
α-互补显色表型(检测标记)
菌落成蓝色
阳性克隆
携带外源DNA
没有外源DNA
全长49kb 可接受15-23kb外源DNA片断
2. λ 噬菌体
2/3的序列为中间基因族
DNA左臂
DNA右臂
可以被
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