实验五一培养基的制备与灭菌.ppt

实验五、土壤中微生物的分离纯化与活菌计数 （一）培养基的制备与灭菌 一、培养基的制备 目的要求 明确培养基的配制原理 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤 基本原理 按培养基的用途分 基础培养基 鉴别培养基 选择培养基 培养基的配方 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（一种天然培养基，用于分离和培养细菌） 高氏Ⅰ号培养基（一种合成培养基，可用于培养放线菌） 马丁氏培养基（一种合成培养基，可用于分离培养真菌） 固体淀粉培养基（一种鉴别培养基，用于大分子物质水解的生理生化鉴定） 葡萄糖蛋白胨水培养基（一种鉴别培养基，用于肠道菌的生理生化鉴定） 器材 溶液或试剂 4mol/L NaOH，1mol/L HCl，各类培养基的配方药品。 仪器或其他用具 试管，三角瓶，搪瓷杯，量筒，天平，药匙，电磁炉，高压蒸气灭菌锅，pH试纸(pH5.5～9.0)，硅胶塞，棉花，报纸，记号笔等。 操作步骤（一） 1． 计算 ：根据配方按照用量计算。 2. 称量： 3．溶解：如有琼脂，要不断搅拌避免糊底。 4、调节pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节，以pH试纸或pH计测定。 5．过滤：趁热用四层纱布过滤。（本次实验省略） 操作步骤（二） 6.分装 试管：固体不超过试管高度的 1/5；液体、半固体不超过试管高度的1/4或1/3 。 三角烧瓶：总体积的一半为限。 管口或瓶口不得沾有培养基 操作步骤（三） 7.加塞 操作步骤（三） 8.包扎：注明培养基的名称。 9.灭菌 ：按不同培养基所需的温度、时间灭菌。 10.搁置斜面 (1/3～l/2，不能超过1/2)。 实验无菌器皿的准备 无菌水：在试管或三角瓶内量取实验所需的自来水， 经121℃ 20min灭菌。 无菌移液吸管、培养皿：报纸包扎后，经121℃ 20min灭菌 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 灭菌是指杀死一切微生物的营养体，芽孢和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生物的营养体，因而只是部分灭菌。 　消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。 干热灭菌 火焰灼烧法 干热灭菌法（烘箱内热空气灭菌法） 湿热灭菌法 加压蒸汽灭菌法 紫外线灭菌法 微孔滤膜过滤除菌 火焰灼烧法 直接在火焰上灼烧灭菌 主要用于实验室接种针(环)、试管口、三角瓶口和金属小工具等的灭菌。 干热灭菌法 设备：电热烘箱 适用于耐高温器皿，160-170℃，维持2小时 注意事项： 温度不可超过180℃，以防玻璃器皿上的棉塞及包装纸烤焦着火。 灭菌时物品不宜堆放得太紧，以免妨碍空气流通。 灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。 电烘箱内温度＜70℃时，方可打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。 2.湿热灭菌(一） 高压蒸汽灭菌法 ：是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内0.1MPa，121℃保持15～30min进行灭菌，从而导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌为准。此法适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。 　　在同一压力下，含有空气的蒸汽所达到的温度低于饱和蒸汽的温度，所以排气是否完全很重要。 间歇灭菌法： 应用于不易于高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，每天加热100℃30min、连续三天，可彻底灭菌。 煮沸消毒法：注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般煮沸消毒时间为10～15min。 超高温杀菌： 此法指在温度和时间标准分别为135～150℃和2～8s的条件下对牛乳或其他液态食品进行处理的一种工艺。 操作步骤（三） 高压蒸汽灭菌法 手提式高压蒸汽灭菌锅 全自动数显立式高压蒸汽灭菌锅 操作步骤（三）（以手提式高压蒸汽灭菌锅为例）  加压蒸汽灭菌法 0.1MPa，121℃，20min灭菌 注意事项： 切勿忘记加水，加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。 锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。 压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。 灭菌全程必须有人看守。 紫外线灭菌法 适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。 紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。 若紫外线照射与3%~5%的石炭酸溶液或2%~3%的来苏尔等化学消毒剂结合使用，可加强灭菌效果。 注意事项： 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。