基因工程的义.doc

基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。 2. 碱抽提法提取质粒DNA 原理和步骤 3、DNA的定量和纯度测定 1. 紫外光谱法 琼脂糖凝胶电泳估计 原理： DNA的凝胶电泳的原理 相同分子量的DNA: 闭合环状卷曲超螺旋迁移最快， 线性分子次之， 伸展开环状最慢。 4. 限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 功能 即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 自我保护作用。用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。各自的特点 I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶 粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：5’端凸出（如EcoR I切点）；’端凸出（如Pst I切点） 限制性内切酶识别的序列 1. 长度：一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基。 4个碱基:sau3AⅠ 5 个碱基:EcoRⅡ 6个碱基:EcoRⅠ 7个碱基:BbvCⅠ 8个碱基:NotⅠ 限制酶识别序列的结构 大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置。 有些识别非对称序列， 有些可以识别多种序列，ACCⅠ识别序列是GT ü MKAC,可以识别4中序列； 有些识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干任意碱基 位点偏爱 (site preferences) 某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。 酶切反应条件 缓冲液，反应温度，反应时间，反应中止 星星活性(star activity) 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。 引起星星活性的因素 ① 高浓度甘油（5%） ② 酶过量（100U/mg） ③ 低离子强度（25mM） ④ 高pH (pH8.0) ⑤ 有机溶剂 PMSD(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）、sulphalane ⑥ 用其它二价阳离子代替Mg++ Mn++，Cu++，Co++, Zn++ 不同的酶对上述条件的敏感性不一样 PstI比EcoRI对高pH更敏感，但后者对甘油浓度更敏感 同裂酶（Isoschizomers) 识别相同序列的限制性内切酶，但它们的切割位点可能不同。 同尾酶(Isocaudamers） 识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等 影响限制性内切酶活性的因素及使用注意事项 1. DNA的纯度 DNA聚合酶 3’?5’外切酶活性 5’?3’外切酶活性 聚合速率 持续能力 大肠杆菌DNA聚合酶 低 有 中 低 Klenow fragment 低 无 中 低 T4DNA聚合酶 高 无 中 低 T7DNA聚合酶 高 无 快 高 化学修饰T7DNA聚合酶 低 无 快 高 遗传修饰T7DNA聚合酶 无 无 快 高 逆转录酶 无 无 低 中 Taq DNA聚合酶 无 有 快 高 2. DNA的甲基化程度 3. 温度 4. 缓冲液(Buffer) T4DNA 连接酶的功能 主要是催化双链DNA一端的3’-OH与另一双链DNA 5’端的磷酸根形成3’,5’-磷酸二酯键，使具有相同粘末端或平端的DNA末端连接起来。 大肠杆菌DNA聚合酶 I ①一条单链多肽。 ②5’?3’外切酶活性位于N端。 5’?3’DNA聚合酶活性 3’?5’外切酶活性 在没有dNTP的情况下，外切活性占主导地位，而当存在足够的dNTP时，外切活性和合成活性将处在动态平衡中，结果使得dsDNA成为平末端。 Klenow fragment 具有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性。（失去了5’?3’外切酶活性）。 在蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解, 从全酶中除去5’—3’外切活性片段，而聚合活性和3’—5’外切活性不受影响。 逆转录酶 依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。 来源 RNA肿瘤病毒。 AMV的性质 二链多肽(62kDa/94kDa) 具5’ →3’DNA聚合活性 具很强的RNA酶H活性(降解与DNA杂交的RNA)