蛋白质相互作用-详解.ppt

有A、B和C：高表达 在A、B和C的蛋白质复合体中，A是和基因调控区结合并有小的转录活性；B可以和A结合促进A的转录活性；C本身不能直接促进A的活性，所以不大可能和A有直接相互作用，但能通过B的介导进一步促进转录。 A B C 蛋白质直接相互作用：从蛋白质物理的相互作用到功能上的相互作用。 蛋白质遗传相互作用：从功能上的相互作用到蛋白质物理的相互作用。 蛋白质相互作用是物理相互作用和功能相互作用的统一 蛋白质直接相互作用：从蛋白质物理的相互作用到功能上的相互作用。 蛋白质遗传相互作用：从功能上的相互作用到蛋白质物理的相互作用。 蛋白质相互作用是物理相互作用和功能相互作用的统一 发现相互作用的蛋白质 相互作用的验证 生物学功能 生物学功能的研究： 相互作用的生物学功能研究基本上可以归为两类：获得功能或失去功能。 生物学问题 技术手段 对问题的认识 相互作用与功能 获得功能：转基因表达，使得原本不表达该蛋白质的细胞表达了蛋白质，从而和已有的蛋白质发生相互作用，细胞有了新的功能。 常用的方法有细胞内转基因过表达蛋白质、转基因老鼠。 失去功能：抑制蛋白质的表达或用dominant negative突变体，使原有的蛋白质缺失或失活，细胞功能的丧失。 常用的方法有：RNA干扰使蛋白质不表达、蛋白质部分功能片断的影响、基因敲除的细胞、基因敲除的老鼠。 从生物学功能的改变到相互作用蛋白质 的发现。 功能性筛选：RNAi，基因敲除小鼠 一些常规生化技术方法：方法和原理 蛋白质等电点计算：对于实验buffer体系pH值有重要作用。 蛋白质浓度的测定：定量分析的基础。 荧光：ECL和细胞免疫荧光。 层析：离子交换、分子筛、亲和层析、反相层析、等。 离心：超速离心。 电泳：SDS、非变性电泳、等点聚焦、等。 Kit方便了我们的实验，但不能方便我们对原理的认识。 谢 谢 GST Pulldown binding wash elution Biotin－Avidin结合：生物界最稳定的结合之一 蛋白质-蛋白质直接相互作用 Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） Affinity interaction（亲和作用） Yeast two-hybrid and phage display（酵母双杂交和噬菌体展示） Surface Plasmon Resonance FRET Proteomic analysis（蛋白质组学技术） Yeast two-hybrid （酵母双杂交） 发现新的相互作用蛋白质 鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用 确定蛋白质间相互作用的功能基团 lacZ UAS DB AD lacZ UAS AD DB lacZ lacZ UAS AD Y DB X lacZ 发现新的相互作用蛋白质 BD B-Pr Marker1 AD 基因库 Marker2 lacZ UAS AD Y lacZ DB B-pr BD B-Pr Marker1 AD 基因库 Marker2 lacZ UAS AD lacZ DB B-pr BD B-Pr Marker1 Y AD 基因库 Marker2 确定蛋白质间相互作用的功能基团 Protein A 1 2 3 4 BD B-Pr Marker1 AD 1 Marker2 AD 2 Marker2 AD 3 AD 3 白 兰 白 白 鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用 BD B-Pr Marker1 AD A-Pr Marker2 兰：相互作用 白：不相互作用 Two-Hybrid的优点： 是酵母细胞内的in vivo相互作用。 只需要cDNA，简单。 弱的相互作用也能检测到。 Two-Hybrid的缺点： 都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用。 酵母的翻译后修饰不尽相同。尤其是蛋白质的调控性修饰。 自身激活报告基因。 对基因库的要求比较高，单向1/3是in frame 蛋白质毒性。 第三者Z插足介导的相互作用。 假阳性。 lacZ UAS DB X lacZ DB X Auto activation BD X Marker1 AD Y lacZ UAS AD Y lacZ AD Y Marker2 Phage display（噬菌体展示） Phage display（噬菌体展示） Phage display的最大优点是数量大 细胞：108~109 细菌：1010 Phage：1012 寻找受体的配体 7肽：8x1016 蛋白质-蛋白质直接相互作用 Co-immunoprecipitation and antigen