兔肝脱氧核糖核酸的提取.ppt

兔肝脱氧核糖核酸的提取 实验目的 掌握从动物组织中提取DNA的原理和方法。 基本原理 步骤： (一)脱氧核糖核蛋白的制备 10ml刻度离心管取8ml兔肝匀浆，3000转10分钟；（取试管标号，加试剂） 弃上清后，沉淀 + 0.15M氯化钠-0.10M乙二胺四乙酸钠8ml ，搅匀后3000转10分钟。弃上清所得即脱氧核糖核蛋白。（加DNA标准液和蒸馏水，二苯胺试剂，加二苯胺试剂的试管不能放在试管架上） （二）DNA粗制品的提取 沉淀 + 0.15M氯化钠-0.10M乙二胺四乙酸钠（终体积为4ml）； 搅匀后 ，逐滴 + 0.5ml 15％SDS，搅拌3-5min ，溶液粘稠略带透明。（DNA与蛋白分离） + 1.0ml5M NaCl（终浓度1M），轻搅3-5min； + 等体积氯仿-异丙醇，加塞（塞紧防漏）振荡3-5min， 3000转10分钟； （实验二的试管放沸水浴） 吸管取上清于一10ml的刻度离心管中，+ 等体积氯仿-异丙醇，加塞（塞紧防漏）振荡3-5min，3500转15分钟；（取出实验二的试管室温放冷并595nm比色，注意添水到水浴锅中） 吸管取上清于一10ml的刻度离心管中，+ 两倍体积的95％的乙醇抽提； DNA析出，弃乙醇后则得到白色DNA粗制品。 *进行实验二的第二步 二苯胺显色法测定DNA含量 实验目的 熟悉751－型分光光度计的使用。 掌握DNA纯度测定的原理和方法 基本原理 DNA在的α-脱氧核糖在酸性条件下转变成ω-羟基-r酮基戊醛，与二苯胺共热后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处最大吸收。 每ml含20－40ug范围内光密度与DNA的浓度成正比。反应液中加入少量乙醛，可提高反应的灵敏度。 步骤 一、 DNA标准曲线的制定 0号管调0，以A为纵坐标，DNA含量（ug /ml)为横坐标，绘制标准曲线。 二、样品含量测定 沸水浴10min，冷却后595nm比色，并从标准曲线上读数。 DNA纯度的测定 原理：核酸在220-320nm处呈特征性吸收，260nm处有最大吸收，测260/280可得知核酸的大致纯度。 260/280 ＝1.6 ~1.8 表示纯 1.8 含RNA 1.6 蛋白含量高 岛津UV-120 有两个光源：紫外和可见光 使用石英杯比色。 * * 二苯胺4ml 二苯胺4ml H2O 2ml 所提DNA 1ml + 1ml NaOH B U