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荧光显微镜及其使用
1.前言
1.1实验目的：
1.1.1掌握荧光显微镜的结构、原理及其荧光显微术，学会用荧光显微镜观察细胞。
1.1.2通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。
1.1.3观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。
1.1.4熟悉荧光显微镜的原理及使用方法。
1.1.5观察荧光染料染色后结合物发出的荧光。
1.2 实验原理：
1.2.1荧光显微镜是荧光显微术的基本装置。荧光显微术是利用一定波长的光（通常是波长短的紫外光和蓝紫光）照射被检样品，激发荧光物质发出可见的荧光。通过物镜和目镜的成像、放大，以供检视和拍摄。荧光显微镜具特殊光源，提供足够强度和波长的激发光，诱发荧光物质发出荧光。视场中所见到的像，主要是样品的荧光映像。
某些物质经波长较短的光线照射后，分子被激活，吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热能或用于光化学反应之外，相当一部分则以波长较长的光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称作荧光。
细胞内大部分物质经短波光照射后，可发出较弱的自发性荧光。有些细胞成分与能发出荧光的有机物质——荧光染料结合。激发后呈现一定颜色的荧光，借以对组织进行细胞化学的观察和研究。
1.2.2将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0~5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。 某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。
本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时,将受到许多因素的影响,如温度,光,淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间, 有必要时立即拍照。另外,在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。
1.2.3吖啶橙荧光染料可与细胞内DNA和RNA结合。其吸收光谱405nm，发射的荧光光谱是530～640nm，因此，吖啶橙和不同的细胞成分结合后，可发射红橙黄绿蓝各色荧光。
2材料和方法
2.1材料：
荧光显微镜；普通离心机；粗天平,；剪刀；研钵；移液管；漏斗； 滴管；10ml刻度离心管；纱布若干；无荧光载玻片和盖玻片；新鲜菠菜；0.35mol/L氯化钠溶液；0.01%吖啶橙(acridine orange)；载玻片、盖玻片、染色缸、牙签；口腔黏膜上皮细胞；0.1mol/L pH7.0 PBS液[A液：NaH2PO4·H20 2.76g加蒸馏水至100ml；B液Na2HPO4·7H20 5.36g加蒸馏水至100ml]；取A液16.5ml、B液33.5ml、NaCl 8.5g用蒸馏水稀释至100ml；0.1％吖啶橙原液（0.1g吖啶橙加蒸馏水至100ml；临用时配制0.01％吖啶橙染液：将0.1％吖啶橙原液用PH7.0 PBS液稀释）；95％乙醇
2.2方法：
2.2.1叶绿体的观察
一，提取
（1）选取新鲜的菠菜嫩叶，洗净擦干后，去除叶梗及粗脉并剪碎，称取2g左右，置于预冷的研钵;
（2）加10ml的0.35mol?L-1 NaCl溶液研磨匀浆;
（3）用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中;
（4）取滤液4ml于1000rpm离心2min，弃去沉淀;
（5）将上清液3000rpm离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）；
（6）沉淀用0.35molL-1NaCl溶液悬浮。
二，叶绿体的观察
（1）滴叶绿体悬浮液一滴于载片上，加盖片；在普通光镜下观察，注意观察所分离的叶绿体的形态以及其是否完整。
（2）滴叶绿体悬浮液一滴于无荧光载片上，加无荧光盖片；在荧光显微镜下观察叶绿体有无自发荧光，其颜色如何。
（3）滴叶绿体悬浮液一滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01％吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察其次生荧光。
三，完整细胞中的叶绿体观察
（1）用镊子撕取一片菠菜叶子表皮，平铺于载玻片上，滴加一滴提取缓冲液，加盖片后轻压，备用。
（2）用镊子撕去菠菜叶子的表皮，用刀片刮下一些叶肉细胞，放于载玻片上，滴加
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