学渣的逆袭-微生物代谢工程.docVIP

第一章 代谢工程定义、主要研究内容及应用方向 定义：通过某些特定生化反应的修饰来定向改善细胞的特性，或运用重组DNA技术来创造新的化合物。 主要内容：①生物合成相关代谢调控和代谢网络理论； ②代谢流的定量分析； ③代谢网络的重新设计； ④中心代谢作用机理及相关代谢分析； ⑤基因操作。 应用方向： 1. 提高细胞现存代谢途径中天然产物的产量； 2. 改造细胞现存的代谢途径，使其合成新产物，这种新产物可以是中间代谢产物或修 饰型的最终产物； 3. 对不同细胞的代谢途径进行拟合，构建全新的代谢通路，从而产生细胞自身不能合 成的新产物； 4. 优化细胞的生物学特性，如：生长速率、极端环境条件和耐受性等。 系统研究代谢流及其控制机制包括的三大基本步骤 ①建立一种能尽可能多的观察代谢网络并测定其流量的方法。 为了做到这一点，通常从测定细胞外代谢产物的浓度入手进行简单的物料平衡。 ②在代谢网络中施加一个已知的扰动，以确定在系统松散之后达到新的稳态时的代谢流。 常用的扰动方式包括启动子的诱导、底物流加、特定碳源消除或物理因素变化等。 ③要系统分析代谢流扰动的结果。 节点、柔性节点、强刚性节点、弱刚性节点、依赖型代谢网络、独立型网络、代谢流分析、弹性系数、流量控制系数。 节点：网络分流处的代谢产物称为节点。 柔性节点：是指由节点流向各分支的代谢流量分割率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加。 强刚性节点：是指由节点流向某一分支或某些分支的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用所致。 弱刚性节点：是指介于前两者之间，由该节点流向各分支的代谢流中有一个是占主导地位的，其酶活较高或对节点代谢的亲和力较大，且无反馈抑制，通过削弱主导分支的酶量或酶活可增加产物的产率。 依赖型代谢网络：如果代谢网络中各节点同等重要，即对产物的产量具有相近的影响，则这类代谢网络称为依赖型代谢网络。 独立型网络：如果代谢网络的主节点不集中，则可以通过对代谢的修饰影响目的产物的产量，这类网络为独立型网络。 代谢流分析是代谢分析的一个重要手段。它假定细胞内的物质、能量处于拟稳态，通过测定胞外物质浓度，再根据物料平衡计算细胞内的代谢流。 弹性系数揭示代谢物浓度变化对反应速率的影响程度。 流量控制系数为单位酶变化量引起的某分支稳态代谢流量的变化，用来衡量某一步酶反应对整个反应体系的控制程度。 阐述代谢工程研究方法和技术主要的三大常用手段 1. 检测技术： 常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究。这包括：体内确定代谢流的物料平衡和同位素标记示踪方法；表征酶促反应进程和性质的酶促反应动力学分析方法;测定同位素富集和关键代谢物相对分子质量分布的光谱学方法(核磁共振、质谱、液相色谱分析和气相色谱分析等)；生物传感器技术。根据这些检测信息可以判断和描述代谢流的基本状态，并为细胞的代谢流及其控制分析提供翔实可靠的原始数据。 2. 分析技术 在获得大量生化反应基本数据的基础上，采用化学计量学、分子反应动力学和化学 工程学的研究方法并结合先进的计算机技术，可以进一步阐明细胞代谢网络的动态特征与控制机理，以确定代谢改造的思路。这些分析手段包括能准确测定细胞内代谢网络流的稳态法、展示代谢流控制过程的扰动法、简化复杂代等提出的的组合法以及代谢网络优化技术等。 3. 基因操作技术 在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可以归结为基因水平上的操作。这个过程涉及几乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术，如基因和基因簇的克隆、表达、调控，DNA 的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化， 基因的体内同源重组与敲除，整合型重组DNA 在细胞内的稳定维持等。 代谢工程技术得以广泛应用的一个重要前提就是外源基因在所有生物物种（包括人体）中转化和表达的可行性，而这种可行性又在很大程度上依赖于各种载体和基因表达调控元件的开发。 (2)扩展代谢途径 在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。 (3)转移或构建新的代谢途 通过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。 论述代谢改造常用三大思路及代谢设计原理 三大思路：1. 改变代谢途径方法 加速限速反应：增加限速酶的表达量