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宜宾职业技术学院 毕业论文 浅谈清瘟解毒散在生产实践中的应用 系 部 清瘟败毒散对肉鸡耐药金黄色葡萄球菌 的抑菌作用 耿梅英，苑方重，杨 倩，钟秀会 (河北农业大学动物医学院，河北保定071000) 中图分类号：$859．79+6 文献标志码：B 文章编号：0529—6005(2014)02—0052—02 金黄色葡萄球菌(SA)是一种广泛存在于自然 界的病原菌，人及多种动物均能感染发病，其中对 肉鸡危害较为严重n～。肉鸡发病后，临床表现为 急性败血症、坏死性皮炎、关节炎、雏鸡脐炎、全眼 球炎和骨膜炎，其中30---40 13龄肉鸡发病最多，每 年给养殖业造成巨大经济损失”1。SA还可以产生 多种引起急性胃肠炎的肠毒素(Staphylococcal en— terotoxins，SEs)，包括A—E，F，G—I，R—T等20多种 类型，可以引起机体中毒9。61；其中，SEA、SEB型可 以结合MHC 11型抗原递呈细胞，并激活T细胞，是 最典型的肠毒素，被称为超级抗原陋1。 相对于抗生素，中药方剂具有低药残留、无公 害、不易耐药等优点，可作为肉鸡葡萄球菌病治疗 的首要选择。很多研究表明，黄连、金银花、连翘 等中药有良好的抗菌作用。本试验选用清瘟败毒 散作为基本方剂进行加减，以黄连、金银花、连翘 等抗菌中药为主药，配伍丹皮、黄芩、甘草等中药， 辨证组方，用于治疗肉鸡葡萄球菌病的研究。 1材料与方法 1．1菌株与材料金黄色葡萄球菌标准菌株 ATCC25923(中国医学微生物菌种保藏管理中心)； 临床分离株S．aureus，分离自河北某地几家肉鸡养殖 场，经却甫曼培养基纯化培养，及生化试验鉴定后保 存应用(图1纯化培养的金黄色葡萄球菌)。Bradford 蛋白定量试剂盒，购自北京研和翔试剂公司；SEA， SEB抗体，购自Sigma公司。0．22 trm滤膜由北京卓 信伟业科技有限公司供应。中药黄连、金银花、连翘 等，购自保定万宝堂药房，组成试验方剂，合并后采 用水煎浓缩方法，药物最终浓度为1 g／mE生药，试验 用单味中药采用同样方法制备。 收稿日期：2013—07—03 基金项目：河北省畜牧局项目(2011) 作者简介：耿梅英(1977一)，女，讲师，硕士，从事临床兽医学研 究．E-maihgengmy@126．corn 通讯作者：钟秀会，E—maihclock8078@126．com 1．2常用抗菌药物耐药性试验将金黄色葡萄球 菌标准株与分离株分别接种于普通平板培养基， 选择链霉素、青霉素G、氨苄青霉素、阿莫西林、林 可霉素、卡那霉素、恩诺沙星、四环素等8种常用抗 菌药物的药敏纸片，进行药物敏感性试验，参考美 国抗微生物药物敏感性判断标准CLSI‘7。8]，判断药 物对试验菌株的抑菌效果。 1．3中药敏感性试验及MIC试验中使用清瘟败 毒散提取液，及组成该方的主要药物黄连、金银 花、连翘、甘草、丹皮分别制成单药提取液。将细 菌接种于普通营养琼脂培养基，采用挖洞注药法 做药物平板抑菌试验。在已接种细菌的培养基上 均匀打孔，将药注满孔，在4℃条件下放置2 h，然 后于37℃培养24 h，使用卡尺测药物对该细菌抑 菌环直径的大小，以确定药物对细菌的作用效果。 利用普通试管，做营养肉汤培养基，将清瘟败毒 散提取液及单味中药提取液，均采用等比稀释的方 法，做成浓度系列。浓度范围是1 g／mL--2-109／n1L 生药，加入营养肉汤中，同时接种细菌，以不加药物 的作空白对比，在37℃下培养24 h，观察含有药物的 肉汤中细菌的生长情况，确定药物对细菌的最小抑 菌浓度(MIC)，判断标准参照CLSI标准M27一A3t81。 1．4清瘟败毒散对S．aureus肠毒素生成的影响 根据MIC试验结果，在接种试验菌株的LB培 养基中MIC浓度的清瘟败毒散方剂提取液，并进 行倍比稀释，以不添加药液的培养基做对照，37℃ 下培养24 h，收集各培养基菌液上清，取20斗L，采 用Western blot方法测定菌液中S．aureus肠毒素 SEA、SEB．。 2 结果 2．1细菌耐药试验参照标准，抑菌环直径大于 20 mm为超敏；抑菌圈直径在15 mm～20 mm，表现 为高敏；抑菌圈直径在10 mm--一14 mm，表现为中 敏；抑菌圈直径小于10 mm，表现为低敏；无明显 万方数据