南农生物分离工程生物分离7亲及.pptVIP

亲和层析;生物亲和作用; 生物亲和作用的本质; ;;; 亲和作用体系 ;; 亲和色谱 ; 亲和色谱填料; 亲和配基;配基的浓度 亲和势较低（ KL ≥ 10-4mol/L），增加配基浓度或增加柱长 大分子配基浓度过高，活性中心相互掩盖， 吸附强，非专一性吸附↑ 理想配基浓度1-10μmol/L，2 μmol/L凝胶 配基分子大小 首选大分子或插入“手臂” ;偶联位置 e结合有效，偶联位置导致 亲和力差异，可吸附不同配体 ;;2. 抗体;;;;;;;;;;亲和吸附载体的种类;常用载体; 3. 葡聚糖凝胶 孔径小，G-200通过105级，配基偶联后， 膨胀度↓，表面亲和病毒、细胞 4. 聚丙烯酰胺凝胶 较多酰胺基，配基偶联后网格缩小 pH2-11，理化稳定，避免接触强氧化剂 5. 多孔玻璃珠（Bio-Glass) 理化稳定，亲水性不强，非特异性吸附， 化学活性基团少 克服：商品连接氨烷基，葡聚糖包被;; 影响亲和力的因素;空间障碍; 配基与载体结合位点 多肽、蛋白作配基，以最少键与载体连接 以ε-NH2表面，较低pH减少连接点，PH＞9.5位点多 胰岛素：pH9.5，2个-NH2连，亲和力1/10 pH6.5，1个-NH2连，;载体孔径 排阻限至少大于配体分子量1个数量级 配基和大分子（抗原抗体）亲和力高或配体很大 （细胞器、完整细胞），多孔不重要，在表面 ;微环境;载体的活化和偶联;;;;洗涤 大量0.1M NaHCO3(pH8.5-9.5)洗涤、抽滤 冷、快（5-10分钟） 偶联 非质子化氨基NH2-P，环境pH＞氨基pK 4℃，4-24h(6h)，后用氨基化合物（乙醇胺） “中和”或“封闭”残存活化基团;;环氧化法;;;;配基偶联方法; 吸附和洗脱; 2. 样品浓度 亲和力大，浓度不重要，太浓影响扩散，专一性下降 亲和力小，浓度↑亲和效果↑峰集中 一般蛋白＜3% 吸附平衡的流速 大分子配体与配基的吸附平衡需较长时间 高温数小时，低温数天 操作：先平衡、低流速＜10ml/c㎡·h 亲和力大，流速快，抗原抗体 亲和力小，流速慢，抑制剂、底物类似物与酶 非特异性吸附：离子效应、疏水基团;二、清洗 清洗：与???附操作相同的缓冲液，确定时间 ;; ;;“负洗脱”：酶必须先结合A才能结合B，一般选A 作配基，若选B作配基，流动相含A， 洗脱时不含A 如NADH使乳酸脱氢酶吸附在固定化丙酮酸类似物上，洗脱液中不含NADH，脱氢酶被洗脱;再生; 应用举例 ;;;;