实验一质粒DNA的提取学案.ppt

实验一 质粒DNA的提取; 实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论 ;实验目的;实验原理;结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位 种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等;;pET-32a Vector;pET-32 cloning/expression region;;;实验仪器、材料与试剂 ;（二） 材料 ;（三） 试剂 ;2. 溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L ）；Tris·HCl（ 25mmol/L， pH8.0）； EDTA （10mmol/L） 3. 溶液Ⅱ： NaOH （0.2mol/L） ；SDS （ 1%，新鲜配制） 4. 溶液Ⅲ： 60ml的 5mol/L KAC ； 11.5ml的冰醋酸 ； 28.5ml H2O;5. 氨苄青霉素（Amp） 用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20℃冰箱保存备用。 6. RNaseA 将RNA 酶 A溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。 7. 酚/氯仿(1:1)，氯仿/异戊醇(24:1)，乙醇 ，75%乙醇。 ;实验步骤 ;6. 15,000rpm，离心10min，将上清移至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，注意所取体积（约400 ? l ） 。 7. 加入等体积酚/氯仿（1:1），颠倒数次混匀（注意动作轻），12,000rpm，4℃，离心3min，取上清液。 8. 小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒数次混匀， 12,000rpm，4℃，离心3min，取上清液。 ;9. 小心吸取上清液中至一干净的1.5 ml Eppendorf 管中，加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，于冰上放置10min， 4℃离心，15,000rpm，10min。 10. 弃上清，加1ml 75%乙醇漂洗沉淀， 4℃离心，10,000rpm，5min。 11. 去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。 12. 加入50 ? l TE buffer，室温振荡溶解质粒DNA。;培养细菌使质粒扩增; ? Tiangen质粒DNA 小量提取试剂盒（实际用） 操作过程 1. 柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500 ? l 的平衡液BL，12,000 rpm 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 2. 将1-2ml 过夜培养的细菌菌液加入1.5ml 离心管中，12,000rpm离心1分钟，并弃去上清液。如有需要，可多次重复步骤2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。 3. 加200 ? l 溶液P1（用前检查是否已加入RNase A），重悬细菌体沉淀，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。;4. 加200 ? l 溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意不要剧烈振动，以防止基因组DNA 被打断，注意不要让反应持续超过5 分钟。 5. 加300 ? l 溶液P3，立即轻柔颠倒离心管6-8 次，充分混匀，此时溶液应该出现白色絮状沉淀。 6. 12,000rpm离心10 分钟。 如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。 7. 将步骤6 离心后得到的上清液转移到吸附柱CP3中，12,000rpm离心30-60秒，并弃去接液管内液体。 8. 向吸附柱CP3 内加600 ? l漂洗液PW ，12,000rpm 离心30-60 秒，并弃去收集管内废液。 9. 重复第8 步一次。;10.将吸附柱CP3 放入收集管中，12,000 rpm 离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 11.将吸附柱CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加40 ? l洗脱缓冲液EB，室温放置2 分钟，12,000 rpm 离心2 分钟，将质粒溶液收集到离心管中。 12. 提取的质粒DNA 可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20℃。;实验结果及讨论