福建农林大学分子生物学课件_2.pptVIP

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福建农林大学分子生物学课件_2

Cloning vectors ;Cloning vectors;质粒;质粒特性: 携带编码多种基因:医学、农业、工业、 环境 细菌进化的重要因子 可以在种内或种间转移 生命和非生命的分水岭:既没有蛋白质外壳,又没有生命外细胞周期,比病毒更简单的原始生命形态,探索生命起源的重要基石。 ;Be capable of vectors;As important tools: easy to isolate easy to manipulate and transformate in vitro development for DNA clone method to express foreign genes in prokaryotes and eukaryotes ; 质粒的表型效应 致育性 1946年,Lederbeger发现大肠杆菌有性生殖,F质粒或性质粒(sexplasmid) 接合作用(conjugation)说明了“自然界存在着天然的基因工程。 绿脓杆菌、抗药性因子(R因子)、大肠杆菌素因子和樟脑分解质粒、放线菌Scp1质粒 ;产生抗菌物质和毒素 col(大肠杆菌素因子): 大肠杆菌素--蛋白质性质的抗菌物质; 大肠杆菌、索氏志贺氏菌、葡萄球菌 pGKL1和pGKL2:线型DNA质粒,致死效应 乳酸克鲁维酵母 scp1:产生抗生素 编码毒素: 产毒素大肠杆菌(人类和动物腹泻); 金黄色葡萄球菌(烫伤皮肤综合症); Bt ;对药物和重金属离子抗性 R因子 R1质粒(94kb) 使宿主对氯霉(Cm)、链霉素(Sm)、磺胺(Su)、氨苄(Ap)和卡那霉素(Km)抗性 对金属离子抗性 碲 (Te+6)、砷 (As3+)、汞 (Hg2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)、银(Ag+)、镉(Cd2+)等 ;利用异常营养物 Pseudomonas、克氏杆菌、短黄杆菌等 将许多化学毒物降解。 降解酶由降解性质粒编码 特殊有机物:樟脑、水杨酸、二甲苯、辛烷环保 对植物的致病性 Ti、Ri ;其他 共生质粒:豆科植物共生固氮的根瘤菌结瘤(nod)和固氮(fix)基因 EcoRI:大肠杆菌Ry13质粒编码 乳糖的利用等特性也与质粒有关 隐秘质粒(cryptic plasmid):不显示任何表型效应的质粒 ;detection  如何判断细菌表现的遗传性状是染色体基因还是质粒基因编码的? 根据:质粒遗传学特性和分子结构特性 ;遗传学特性 a. 消除(curing) b. 遗传转移 c. 分子杂交 ; 理化因子消除 ;生物学方法:原生质体形成和再生; 结构特性 DNA结构和物理学特征:质粒与染色体不同 a. 离心: 密度不同 b. agarose电泳: 分子量大小 c. 电镜观察: 1μm dsDNA=3000bp d. 再转化;质粒的拷贝数 质粒拷贝数一般与其分子量成反比关系: 质粒拷贝数=质粒DNA量/染色体DNA量×MWc/MWp 质粒的不相容性(incompatibility) 在没有选择压力的条件下,两种不同质粒不能共存于同一宿主细胞内的现象。 不相容质粒携带复制子基本相似,复制系统也相同,在复制和分配到子细胞的过程中相互竞争。 ; plasmid vectors 1、是一独立的复制子; 2、有筛选标记; 3、具有酶切位点或多克隆位点; 4、分子量小,拷贝数高。 ;质粒载体的设计;构建质粒载体 (1)分子量尽量小。>15kb时转化效率低。 小质粒优点:①容易提取; ②较为抵抗机械(超声波)切割; ③多拷贝,给克隆基因提供了剂量效应; ④对内切酶提供多切点的机会大为减少。 (2)了解载体上基因位置/限制酶作用位点。 (3)包含可供选择的标记性状(基因) (4)应有另一个遗传标记基因(抗生素常用), (5)最大限度地具有MCS的单切点 ;质粒载体多种用途;质粒载体筛选方法;质粒载体缺点; ? phage vector 48.5 kb双链DNA。 cos位点(cohesive end site):在DNA两端各有12nt的5`单链突出,彼此序列互补。它是包装时的切割信号。 插入型载体:在DNA非必需区插入外源片段。携带的外源片段小于2kb。 取代型载体:外源片段取代了?DNA非必需区,可携带20kb的外源片段。 ;Cosmid vector;Phasmid载体; YAC vectors BA

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