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福建农林大学分子生物学课件_2
Cloning vectors;Cloning vectors;质粒;质粒特性:
携带编码多种基因:医学、农业、工业、
环境
细菌进化的重要因子
可以在种内或种间转移
生命和非生命的分水岭:既没有蛋白质外壳,又没有生命外细胞周期,比病毒更简单的原始生命形态,探索生命起源的重要基石。
;Be capable of vectors;As important tools:
easy to isolate
easy to manipulate and transformate
in vitro
development for DNA clone method
to express foreign genes in
prokaryotes and eukaryotes
; 质粒的表型效应
致育性
1946年,Lederbeger发现大肠杆菌有性生殖,F质粒或性质粒(sexplasmid)
接合作用(conjugation)说明了“自然界存在着天然的基因工程。
绿脓杆菌、抗药性因子(R因子)、大肠杆菌素因子和樟脑分解质粒、放线菌Scp1质粒
;产生抗菌物质和毒素
col(大肠杆菌素因子):
大肠杆菌素--蛋白质性质的抗菌物质;
大肠杆菌、索氏志贺氏菌、葡萄球菌
pGKL1和pGKL2:线型DNA质粒,致死效应
乳酸克鲁维酵母
scp1:产生抗生素
编码毒素:
产毒素大肠杆菌(人类和动物腹泻);
金黄色葡萄球菌(烫伤皮肤综合症);
Bt
;对药物和重金属离子抗性
R因子
R1质粒(94kb)
使宿主对氯霉(Cm)、链霉素(Sm)、磺胺(Su)、氨苄(Ap)和卡那霉素(Km)抗性
对金属离子抗性
碲 (Te+6)、砷 (As3+)、汞 (Hg2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)、银(Ag+)、镉(Cd2+)等
;利用异常营养物
Pseudomonas、克氏杆菌、短黄杆菌等
将许多化学毒物降解。
降解酶由降解性质粒编码
特殊有机物:樟脑、水杨酸、二甲苯、辛烷环保
对植物的致病性
Ti、Ri
;其他
共生质粒:豆科植物共生固氮的根瘤菌结瘤(nod)和固氮(fix)基因
EcoRI:大肠杆菌Ry13质粒编码
乳糖的利用等特性也与质粒有关
隐秘质粒(cryptic plasmid):不显示任何表型效应的质粒
;detection
如何判断细菌表现的遗传性状是染色体基因还是质粒基因编码的?
根据:质粒遗传学特性和分子结构特性
;遗传学特性
a. 消除(curing)
b. 遗传转移
c. 分子杂交
;理化因子消除;生物学方法:原生质体形成和再生; 结构特性
DNA结构和物理学特征:质粒与染色体不同
a. 离心: 密度不同
b. agarose电泳: 分子量大小
c. 电镜观察: 1μm dsDNA=3000bp
d. 再转化;质粒的拷贝数
质粒拷贝数一般与其分子量成反比关系:
质粒拷贝数=质粒DNA量/染色体DNA量×MWc/MWp
质粒的不相容性(incompatibility)
在没有选择压力的条件下,两种不同质粒不能共存于同一宿主细胞内的现象。
不相容质粒携带复制子基本相似,复制系统也相同,在复制和分配到子细胞的过程中相互竞争。
;
plasmid vectors
1、是一独立的复制子;
2、有筛选标记;
3、具有酶切位点或多克隆位点;
4、分子量小,拷贝数高。
;质粒载体的设计;构建质粒载体
(1)分子量尽量小。>15kb时转化效率低。
小质粒优点:①容易提取;
②较为抵抗机械(超声波)切割;
③多拷贝,给克隆基因提供了剂量效应;
④对内切酶提供多切点的机会大为减少。
(2)了解载体上基因位置/限制酶作用位点。
(3)包含可供选择的标记性状(基因)
(4)应有另一个遗传标记基因(抗生素常用),
(5)最大限度地具有MCS的单切点
;质粒载体多种用途;质粒载体筛选方法;质粒载体缺点; ? phage vector
48.5 kb双链DNA。
cos位点(cohesive end site):在DNA两端各有12nt的5`单链突出,彼此序列互补。它是包装时的切割信号。
插入型载体:在DNA非必需区插入外源片段。携带的外源片段小于2kb。
取代型载体:外源片段取代了?DNA非必需区,可携带20kb的外源片段。
;Cosmid vector;Phasmid载体; YAC vectors
BA
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