4目的基因的获取.pptVIP

第四章 目的基因的获取;1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。;① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH;（2）合成过程;化学合成的DNA片断一般在200bp以内。 ;T4 DNA连接酶;2. 互补延伸连接法;1. 直接合成基因;DNA合成仪; 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。;;（1）限制性内切酶法;由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。;（2）机械切割法;（2）目前常用的载体 ;断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。;（2）载体与基因组DNA大片段的连接;各种酶的接头可以向公司定做或购买。;（3）重组载体导入受体细胞;5. 基因组文库的大小;;1. cDNA;（1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。;分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。 ;;反转录酶;用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。;剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。;④去掉发卡结构;;这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。;;;在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。;;6. cDNA文库的大小;三、文库的查询（screening）;1. 直接从基因组中扩增;;（1）提取基因组 total RNA;纤 维 柱;;克隆外源基因