亲和层析Affinity Chromatography.pptVIP

亲 和 层 析 Affinity Chromatography;一、概述;优点：1.纯化过程简单、迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和 缺点：1.针对某一分离对象就需要制备专一的 吸附剂和建立相应的实验条件 2.配基的选择及其与基质的共价结合需 要烦琐的操作步骤 ;二、基本原理;; 1.具有专一性亲和力的生物分子对： 酶—底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅 酶因子） 特异性抗原—抗体 激素—受体 DNA—互补的DNA或RNA 凝集素和糖蛋白;2.基本过程： ?固相化 ? (Immobilise) ? 配基Ligand:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆结合的生物专一性物质。 基质Matrix(载体):亲和层析中与配基共价结合,使其固相化的物质。;?吸附 ?(Adsorption) ? ?解吸 (Elution );;三、载体的选择;可供选择的载体;聚丙烯酰胺凝胶 商品名：Bio-Gel p 型号：P-100至-300 型号含义：排阻限度，X1000相当于允许进入凝胶内部蛋白质的最大分子量 特点：干胶，理化性质稳定,抗微生物侵袭能力较大,适用于配基和亲和物之间亲和力比较弱的系统,应避免在pH2-11以外的溶液中长期使用. ;葡聚糖凝胶 商品名:Sephadex 型号:G-100,150,200 型号含义:每克干凝胶吸水量X10 特点:理化性质稳定,耐热耐碱不耐酸,网孔小;四、配基的选择; 以酶和底物为例来讨论配基与欲纯化的生物物质的亲和性: KL E+L?EL 在亲和层析中,定义分配系数Kd为: Kd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/KL 常数KL越小,配基对大分子的亲和力越高,在亲和层析中就越有价值。;配基可以是小分子物质：一些辅酶、辅基 大分子物质：酶、抗体 纯化酶的配基:底物、酶活性中心、抑制剂、辅酶、辅基等； 纯化抗原抗体的配基：互为配基 纯化核酸的配基：DNA和RNA，蛋白质和mRNA ;五、配基的固相化;;六、亲和层析分离;（三）洗脱 1.洗脱后可能出现的洗脱图谱 酶与杂质一起流出 ? ? 酶与杂质没有完全分离 ? ? 酶与杂质完全分开 ;2.洗脱方法 ?非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离子强度、介电常数或温度使物质构象改变，浓缩、洗脱后立即中和稀释或透析，使蛋白质迅速恢复到天然结构 ?特异性洗脱：再次利用生物学特异性只洗脱和配基专一作用的酶，不洗脱由于非专一吸附上去的杂蛋白;（四）再生 亲和层析拄可在一次层析后用大量洗脱剂连续洗涤，然后再用平衡缓冲液平衡，经处理后的层析柱能再次使用。 ;七、亲和层析的应用;Figure 1. Loading affinity column.;Figure 2. Proteins sieve through matrix of affinity beads.;Figure 3. Proteins interact with affinity ligand with some binding loosely and others tightly. ;Figure 4. Wash off proteins that do not bind. ;Figure 5. Wash off proteins that bind loosely.;Figure 6. Elute proteins that bind tightly to ligand and collect purified protein of interest.;亲和层析法分离豌豆凝集素;[原理] 亲和层析技术利用豌豆凝集素可与葡聚糖凝胶发生特异性结合，再用含葡萄糖的氯化钠溶液将豌豆凝集素洗脱下来。比较豌豆凝集素和杂蛋白对兔红细胞凝集作用的差异来进行鉴定。 ;[器材] 1.层析柱 2.恒温孵育箱 3.反应板 ;[试剂] 1.1mol/L NaCl洗脱液 2.0.2mol/L葡萄糖NaCl洗脱液 3.Sephadex G-50 4.兔红