第八章目的基因的制备.pptVIP

目的基因的制备;目的基因: 为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中分离其编码蛋白（酶）的基因，创造出有价值的新物种。;目的基因的制备: 构建基因组文库 构建cDNA基因文库 利用聚合酶链式反应技术 基因的化学合成;基因文库;;基因组文库构建;基因组文库必须符合的基本条件： 文库能够覆盖整个基因组 插入的片段比较大 文库比较稳定，且容易保存和操作; 基因组文库的大小： N=ln(1-P)/ln(1-f ) N：文库必需的克隆数 P：文库中目的DNA片段的出现概率 f：插入片段大小/全基因组大小的比值; 期望值为0.99，插入片断为20kb的 E.coli (4.6×106 bp) 和 human (3×109 bp) 基因组的克隆数的计算 N E.coli= =1.1 ×103 ;;有一些序列不能被克隆 Example: 1.序列缺乏酶切位点; 2.目的基因包容在一个其大小范围超出载体承载能力的DNA片断上 ;基因组文库构建的基本步骤： 大片段DNA克隆载体的准备 大分子质量的植物基因组DNA制备 大片段DNA分子的部分酶切 载体与外源片段的连接 载体的遗传转化;载体 ; ?利用质粒载体 构建基因组文库;利用λ噬菌体构建基因组文库;利用考斯质粒构建基因组文库;利用YAC构建基因组文库;cDNA文库;基因组文库 包含该生物基因组DNA全部的序列 是具有生物种属特异性的。 cDNA文库: 已经过剪接、去除了内含子的cDNA。 具有组织细胞特异性;cDNA文库的构建; mRNA纯化的方法:以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效。 原理：利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱。;mRNA与oligo(dT)杂交而被吸附，其它RNA仍处于游离状态;利用聚合酶链式反应技术;以已知序列为基础的克隆方法;;;测 序;RACE-PCR（末端快速扩增技术 ）;以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法;定位克隆（图位克隆); 从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆插入片段含有??探针重叠顺序和染色体的其他顺序。从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段，等于在染色体上移了一步，故称之为染色体步移 。 ;基因组 文库;使用此种方法的目的？（在什么情况下用） 基于什么技术（方法） 基本过程（基本原理）;以人工突变体为基础的基因克隆方法;;Ti质粒;基因标鉴法：该法是利用转座子或T-DNA插入植物 的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然 后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选， 获得突变体，以此克隆目的基因。;转座子标签法克隆基因步骤;以表达差异为基础的基因克隆方法;文库扣除杂交法;表达目的基因的组织或细胞;mRNA差异显示反转录PCR;;抑制消减杂交法;抑制性消减杂交示意图;技术： 杂交二级动力学原理：即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使原来在丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致。 抑制PCR：是利用链内退火优于链间退火的特点，使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。