凝胶层析柱特性测试综述.doc

生物化学实验报告——凝胶层析柱特性测试  PAGE \* MERGEFORMAT - 7 - 凝胶层析柱特性分析 （实验报告） 实验日期：2015年4月21日 实验温度：室温 实验地点：生物化学与遗传学实验室 指导老师：****** 班级：2013级生物技术1班 姓名：***** 学号：****** I. 实验目的 1.掌握凝胶层析柱的基本原理； 2.学习凝胶层析柱的操作技术； 3.了解凝胶层析柱的应用。 II. 实验原理 凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。把含有不同大小分子的混合液，铺加在胶面上，让它流过凝胶柱。由于凝胶具有网络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中的溶质凡是比网孔小的分子，都能自由进入颗粒内部，而比网孔大的分子则不能进入。因此，在洗脱过程中，大分子物质必然先于小分子物质向下移行，先流出的是大分子物质，小分子物质后流出，从而达到分离的目的。 在凝胶层析中，凝胶粒子间隙的外水相当于移动相，粒子内水相当于固定相。当溶质随洗脱液自上向下移动时，溶质在内水之间连续不断达成分配平衡。相对分子质量大的因不易渗入凝胶孔内，分配系数较小，用较少的洗脱液就能从柱中洗脱出来；反之，相对分子质量小的因渗入凝胶孔内，分配系数较大，需较多的洗脱液才能从柱中洗脱出来。 为了精确地衡量混合物中某一被分离成分在一定的凝胶柱内的洗脱行为，常采用分配系数Kd来衡量，Kd的定义为： 式中 Ve ——某一成分的洗脱体积，即从加入样品算起， 到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积； Vo ——层析柱内凝胶凝胶颗粒之间空隙的总体积， 又称凝胶外水体积； Vi ——层析柱内部微孔的总体积，亦称为内水体积。 洗脱体积Ve与Vo及Vi之间的关系可表示为： Ve=Vo+KdVi 当某种成分的Kd值为0时，意味着这种成分完全被排阻于凝胶建立的微孔之外而最先洗脱出来，即Ve=Vo。可以用一个已知相对分子质量远远超过凝胶排阻极限的有色分子如常用蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，可测出柱床的外水体积Vo。 当另一种成分的Kd=1时，意味着这一成分完全不被排阻，它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，在洗脱过程中它将最后流出柱外，Ve=Vo+Vi。 处于上述极端情况（即分子最大与最小）之间的那些分子，它们Kd值在大于0小于1的范围内。由此可见，Kd值得大小序列决定了被分离物质流出层析柱的顺序。Kd只与被分离物质分子的大小和凝胶孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关。 将凝胶装柱后，柱床总体积Vt是三种体积的总和，即凝胶颗粒外水体积Vo、凝胶颗粒内部的体积Vi和干凝胶颗粒体积Vg之和：Vt=Vo+Vi+Vg。 Vt可从柱的直径d和高度h计算：1/4πd2h。 用有效分配系数（Kav）代替Kd，其定义为： 本实验使用蓝色葡聚糖凝胶Sephadex G-50，其适用的相对分子质量范围在500～10000葡聚糖（线性分子）和1500～30000之间的多肽与蛋白质的分离。已含蓝色葡聚糖2000（相对分子质量在200万以上，呈蓝色）、细胞色素C（相对分子质量12400，呈红色）、铁氰化钾[K3Fe(CN)6，相对分子质量329.26，呈黄色]的混合液做样品。当混合液流经G-50色谱柱时，三种有色物质因Kd不同，分级分离明显可见。通过作洗脱曲线可以计算出凝胶层析的特性参数。 III. 实验试剂与仪器 1.实验试剂 Sephadex G-50，蓝色葡聚糖-2000，细胞色素C，铁氰化钾K3[Fe(CN)6]，洗脱液Tris-HCl（0.05mol/L pH 7.5）。 2.实验器材 层析玻璃管（1cm×20cm），试管，烧杯，注射器，滴管、微量移液器，玻璃棒等。 IV. 实验操作步骤 1. 凝胶溶胀 称取3gSephadex G-50加入到50mL 蒸馏水中，沸水溶胀2h。用倾斜法除去凝胶上层水及细颗粒，以蒸馏水反复倾洗3～4次（此时无细小颗粒），再用0.05mol/L Tris-HCl（pH 7.5）洗脱洗涤后，将凝胶保存在洗脱液内。 2. 装柱 将层析柱垂直地安装好，柱内装入洗脱液（dH2O），排除层析柱板下的空气泡，关闭底部出口，柱内留下约柱体积四分之一的洗脱液。加入搅拌均匀的Sephadex G-50的浆液，浆液不可太稀或太粘稠。装填时用一根玻璃棒，让浆液沿玻棒流入柱内（注射器灌柱，控制高度），同时打开柱底部出口，调流速0.3mL/min（10～12滴/min）。凝胶随柱内溶液慢慢流下