核糖体S6激酶对肝星状细胞内胶原表达的论文.docVIP

　　核糖体S6激酶对肝星状细胞内胶原表达的论文 【摘要】 目的： 探讨核糖体s6激酶（p90rsk）调节肝星状细胞（hsc）ⅰ型胶原表达的作用. 方法： 将设计的p90rsk特异性sirna克隆至真核表达载体pavu6+27中，构建p90rsk的rna干扰真核表达载体pavrski. 将构建的pavrski通过脂质体瞬时转染hsct6，分别采用实时定量聚合酶链式反应和rna和蛋白表达. 将p90rsk的真核表达质粒（pmt2rsk1）和pavrski分别与ⅰ型胶原启动子荧光素酶报告基因质粒（pgl3col1a1）共转染原代hsc，48 h后检测细胞的荧光素酶活性. 结果： 构建的pavrski能够有效抑制hsct6中p90rsk mrna和蛋白表达，与对照组相比较分别减少了（70.20±4.04）%和（89.10±5.26）%（plt;0.01）. hsct6中ⅰ型胶原的mrna和蛋白的表达，与对照组相比较分别减少（61.80±3.96）%和（98.50±7.01）%（plt;0.01）. 各组转染pmt2rsk1，pavrski和空载质粒的hsc中，ⅰ型胶原启动子活性之间的差异无统计学意义（pgt;0.05）. 结论： p90rsk参与了hsc中胶原的表达调控，可能成为肝纤维治疗的新靶点. 【关键词】 核糖体蛋白质s6激酶类；肝/细胞学；星形细胞；胶原ⅰ型；rna干扰 0引言 核糖体s6激酶（90kda ribosomal s6 kinase, p90rsk）隶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，是细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase 1 and 2, erk1/2）信号转导通路的重要效应分子，具有在多种细胞内调控基因转录、细胞周期以及维持细胞生存等生物活性［1-2］，在肿瘤的发生及神经系统发育中具有重要的调控作用［3］. 活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell, hsc）是肝纤维化时细胞外基质的主要来源和发生、发展的中心环节［4］. 研究［5-6］表明p90rsk在肝纤维化中表达增加，并参与诱导hsc的凋亡. 然而p90rsk是否参与调节hsc内胶原的表达及其可能机制，目前国内外尚少见报道. 本实验采用rna干扰、报告基因等技术，研究hsc内p90rsk调节胶原表达及其分子机制，为临床治疗肝纤维化提供新的思路. 1材料和方法 1.1材料雄性sd大鼠250～300 g（南京军区南京总医院实验动物中心）；pmt2rsk1由美国哈佛大学医学院avruch教授惠赠. pavu6+27由美国密歇根大学生物化学实验室engelke教授惠赠. 携带大鼠ⅰ型胶原启动子及萤火虫荧光素酶基因的pgl3col1a1由东南大学实验中心提供. 肝星状细胞株hsct6由美国西奈山大学肝脏中心实验室friedman教授惠赠，其表型为活化的hsc. 小鼠抗大鼠rsk抗体（美国bd 公司）；兔抗大鼠ⅰ型胶原抗体（武汉博士德公司）；荧光素酶检测试剂盒（美国promega公司）；ck40型电转化仪，icyclertm 光学荧光定量pcr仪，pac3000蛋白电泳仪，半干转膜仪（美国biorad公司）；ck40倒置显微镜（日本olympus公司）；聚偏二氧乙烯膜（pvdf）（美国schleicher schuell公司）；lipofectamim2000试剂（美国invitrogen公司）；牛血清白蛋白（美国sigma公司）. 1.2方法 1.2.1hsc原代细胞的分离培养大鼠称重后以戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉后，以10 u/l肝素钠1 ml/kg将大鼠肝素化，暴露门静脉，插管，以37℃无钙灌流液预灌流，40~50 ml/min，持续约10 min；其后用酶灌流液继续灌流，40~50 ml/min，持续时间为10~15 min. 取出肝脏，剪碎、消化、过滤，滤液离心，1700 r/min，离心7 min，弃上清，用dhanks清洗，1700 r/min，离心7 min；弃上清，沉淀以1∶2体积的180 g/l的nycodenz混匀，行密度梯度离心，3400 r/min，离心17 min；取界面处细胞，用dmem清洗2次，1700 r/min，离心7 min；取沉淀细胞悬浮于含200 ml/l小牛血清的dmem中，用台盼蓝染色判断存活率；将细胞以1×105/cm2接种于培养皿，置37℃，50 ml/l co2培养箱培养，24 h细胞贴壁后换液；倒置显微镜下观察所分离的hsc形态和培养后的形态变化；在荧光显微镜328 nm波长的紫外光激发下，观察hsc的自发荧光. 1.2.2rnai载体的构建及鉴定通过网站的sirna设计软