免疫组化-ABC试剂盒法.docVIP

免疫组化ABC试剂盒(VECTOR)操作流程 工作液准备 封闭血清（黄色小瓶子）：3滴原液+10mL的缓冲液混合，装入黄色的大瓶子； 生物素二抗（蓝色小瓶子）：1滴原液+10mL的缓冲液混合，装入蓝色的大瓶子； ABC复合物：2滴A液加入10mL的缓冲液混合后，加入2滴B液混匀后装入标有ABC的大瓶子。此处反应需要30min。1滴大概50uL 试剂（自备） 二甲苯、PBS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、 一抗稀释液： 3%BSA in TBS，pH7.4 DAB工作液：1ml PBS加入50ul DAB stock solution 、50ul Hydrogen Peroxide solution充分混匀 步骤 1.脱蜡和水化 ? ?脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。 ? ?1）组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；? ?2）无水乙醇中浸泡5min；? ?3）95%乙醇中浸泡5min； ? ?4）70%乙醇中浸泡5min； ? ?2.PBS洗两次各5min。? ?3.抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片。煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热 0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织切片加热10~15min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。 ? ?4.PBS洗5min。 5.用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10min，PBS洗3次，每次2min。? ?6.滴加封闭血清工作液，室温封闭20min，以减少非特异背景，无需冲洗只需吸去多余血清。? ?7.滴加一抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。? ?8.PBS洗3次每次2min。? ?9.滴加生物素二抗工作液，室温度孵育30min。 ? ?10.PBS洗3次每次2min。 11.滴加ABC复合物（提前30min，A液与B液等量混合），室温孵育30min。 12.PBS洗3次每次2min。? ?13.DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。? ?14.蒸馏水洗，苏木素复染45s。? ?15.脱水：把切片放入50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇中脱水，每次2min。 16.透明：将切片放入100%二甲苯10min透明。 17.中性树脂50ul封片，室温保存。 备注： 1、VECTOR试剂盒只提供封闭血清、生物素二抗、ABC复合物。一抗、过氧化氢、DAB需自备。 2、步骤9、11的敷育时间可在37度下缩短。 3、配置工作液时尽量用新鲜的缓冲液，以防细菌污染影响染色结果。 4、配置ABC复合物用的A液和B液应该是同一试剂盒的。