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微生物感染的病原学检查法 文 / 张力平 微生物感染的病原学检查可查明标本中的病原微生物并对其进行种属鉴定，必要时进行药物敏感试验和毒力检查等，从而协助医生对感染性疾病进行病因学诊断、指导合理用药或观察治疗效果。 微生物感染的病原学实验室诊断方法大致包括：①光学显微镜对标本或组织中的病原体的形态学检查；②病原体的分离培养和鉴定；③用免疫学技术对病原体抗原或相应抗体的检测；④用分子生物学方法对病原体特异性基因的检测。 标本的采集与送检 微生物学检查的第一步，方法的正确与否直接影响病原体的检出率，因此应注意下述原则： 1．采集标本时应无菌操作，尽量避免污染；盛放标本的容器和培养基应预先进行无菌处理并贴好标签。 2．应选择感染部位或病变明显的部位采集标本，避免周围组织、器官或分泌物中的杂菌污染。例如感染性伤口，应从其深部而不是从表面采集标本；若采集龈沟液检查口腔厌氧菌，应将无菌滤纸条深入龈沟中，停留数秒后取出；怀疑细菌性痢疾时，应采集有粘液或脓血的粪便；采集病毒的标本应尽量含有感染的细胞。 3．根据病原体在感染性疾病的不同时期的体内分布和排出部位选择在最佳时间采集适宜标本。例如，可疑伤寒的病人，在病程的1～2周内取血液，2～3周时则取粪便或尿液送检；怀疑流行性脑膜炎的病人，应选取脑脊液、血液或皮肤上的出血淤斑进行检测；如果进行病毒培养或其抗原检测，一般应取急性期标本，标本采集越早，病毒的阳性检出率越高。 4．对于怀疑细菌感染的标本，尽量在抗生素使用前采集，特别是对抗生素敏感的病原体，如乙型溶血性链球菌、脑膜炎奈瑟菌。病毒对抗生素不敏感，故无此限制。而且用于病毒分离培养的标本应加入抗生素，以避免在病毒培养过程中的细菌污染。 5．检查病原体的特异性抗体IgG时，应采集急性期和恢复期双份血清，只有当恢复期血清抗体效价比急性期的效价明显升高达4倍或以上时，方有诊断价值。检测血清特异性抗体的标本应保存在-20℃。 6．标本采集后应及时送检。大多数细菌标本应冷藏送检，但是某些细菌，如脑膜炎奈瑟菌对低温和干燥极其敏感，应注意保温，尽量床旁接种，并预温相应的培养基。病毒在室温中易于灭活，应立即接种；如需运送，以4℃为宜；若需保存较长时间，加入适当的保护剂如甘油或二甲基亚砜后，放入-70℃保存。 第一节 细菌感染的微生物学检查法 医生根据临床上诊断和治疗的需要选择不同的标本和检查方法进行实验室诊断，从而鉴定出感染的病原菌。实验室诊断包括细菌学诊断，即检测及鉴定病原菌；检测病原菌成分（抗原和核酸）以及检测患者血清中特异性抗体（图8-1）。 图8-1 细菌感染的实验诊断方法 一、细菌学诊断 形态学检查 光镜下可观察直接涂片或分离培养的细菌形态（包括染色标本和不染色标本），直接涂片染色只对特定样品中的细菌有诊断价值。如在患者脓性脑脊液或淤血点中的白细胞内检出革兰染色阴性的双球菌即可诊断为流行性脑膜炎；在生殖器官病变部位的标本中发现革兰染色阴性的双球菌，结合临床症状即可初步诊断为淋病奈瑟菌感染。但很多细菌的形态和染色性缺乏明显特征，仅凭形态学不能做确切的诊断，需经细菌的分离培养，甚至纯培养后，对细菌进行生化和血清学鉴定，方能明确感染的细菌。 不染色标本主要用于检查细菌的动力，如在镜下观察标本有无“鱼群”样排列、运动活泼的细菌，可对霍乱弧菌进行初步诊断。 1．细菌染色检查法 主要包括革兰染色、抗酸染色和荧光染色后光镜检查。 （1）革兰染色法（Gram stain）：是在1884年由革兰（Hans Christian Gram）发明的，它一直是对细菌进行分类鉴别的最常用染色方法。 （2）抗酸染色法（acid-fast stain）：是鉴定结核和麻风等分枝杆菌属细菌的重要方法。细菌经涂片、干燥和固定后，先用5%石炭酸复红初染，细菌被染成红色，然后用3%盐酸酒精脱色，由于分枝杆菌细胞壁富含脂类物质，一旦着色，盐酸酒精难以将其脱色，故为抗酸染色阳性（红色）。而一般的细菌容易脱色，再经美兰复染呈现蓝色。若在痰液中检出抗酸染色阳性的杆状细菌，则可诊断患者有结核分枝杆菌的感染。 用金胺对结核杆菌进行染色，在荧光显微镜下可观察到呈金黄色荧光的菌体，此法可提高结核分枝杆菌的检出率。 另外，有一些特殊的染色方法可将细菌的特殊结构，如细菌的鞭毛、荚膜和芽胞进行染色。 2．暗视野检查（darkfield examination） 在普通光镜上配置特制的暗视野聚光器即成暗视野显微镜，其反光镜反射过来的光线不能进入镜筒，使背景视野变暗。而光线只能从暗视野聚光器周围边缘斜射到菌体上，由于散射作用而使菌体发光，反射到物镜映入眼中。因此在暗视野中可看到发亮的细菌。本方法易于观察不染色活菌，故常用于检查活菌、螺旋体及其动力。 病原菌的分离培养 原则上应对所有送检标本做分离培养，以便获得单个菌落后