破骨细胞在中耳胆脂瘤骨质破坏中的作用.docVIP

　　破骨细胞在中耳胆脂瘤骨质破坏中的作用 作者：叶胜难， 马艳利， 易自翔 【摘要】 　　目的 探讨破骨细胞（OC）在胆脂瘤骨质破坏中所起的作用。 方法 通过免疫组织化学技术和 计算 机图像定量分析法，检测破骨细胞分化因子（RANKL）和骨保护素（OPG）在27例胆脂瘤和11例外耳道皮肤中的表达。光镜观察8例胆脂瘤周围破坏听小骨和2例正常听小骨的形态学；透射电镜观察5例胆脂瘤周围破坏听小骨和2例正常听小骨的超微结构。 结果 RANKL的阳性表达量在胆脂瘤中为（0.247 0±0.210 1），在外耳道皮肤为（0.045 2±0.078 9）（Plt;0.05）；RANKL/OPG比值在胆脂瘤中为(1.379 0±1.138 0)，在外耳道皮肤为(0.358 1±0.376 8)（Plt;0.05）；OPG在胆脂瘤中的阳性表达量为(0.202 6±0.094 9), 在外耳道皮肤中的阳性表达量为(0.262 7±0.172 4)（Pgt;0.05）。胆脂瘤周围破坏听小骨中有活性OC存在以及其参与骨破坏作用的证据。 结论 OC在胆脂瘤的骨质破坏中发挥一定的作用。 【关键词】 胆脂瘤，中耳； 破骨细胞； 破骨细胞分化因子； 骨保护素 　　胆脂瘤是一种由复层鳞状上皮包绕脱落上皮或角化物的囊性结构，囊外包被一层厚薄不一的纤维组织，与邻近的骨壁紧密相连，随着胆脂瘤的不断增大，压迫、破坏周围骨质，引起严重的颅内外并发症，重者危及生命。因此了解胆脂瘤骨质破坏的发生机制对于阻断疾病的 发展 及减少并发症的发生至关重要。关于胆脂瘤的骨破坏机制一直没有定论，国内外学者提出破骨细胞（osteoclast，OC）可能是胆脂瘤骨质破坏的最终作用细胞[1]。本研究通过免疫组织化学技术和形态学观察，从直接和间接两方面探讨OC在胆脂瘤骨质破坏中的作用。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 胆脂瘤标本选自1998年1月-2005年12月手术 治疗 的27例患者，男性16例，女性11例，年龄（34.80±11.02）岁（15～67岁），均为第一次手术，诊断经病理证实。取其中11例患者的外耳道深处正常皮肤作对照。取其中8例患者的破坏听小骨做光镜观察，5例患者的破坏听小骨做电镜观察，2例尸体解剖的正常听小骨作对照。 　　1.2 方法 　　1.2.1 免疫组织化学染色 将新鲜标本按标准石蜡包埋技术流程制成蜡块，作厚度4 μm连续切片，备用。免疫组织化学染色采用SP法，一抗分别为鼠抗人破骨细胞分化因子（receptor activator nuclear factor kappa B ligand，RANKL）抗体和鼠抗人骨保护素（osteoprotegerin,OPG）抗体（均购自美国Zymed公司）。主要操作步骤：石蜡切片脱蜡水化，3%过氧化氢室温孵育20 min，抗原修复（高压修复2 min），5%正常山羊血清封闭20 min，滴加一抗（工作浓度分别为RANKL 1∶50、OPG 1∶50），室温下孵育3 h，滴加生物素标记的二抗，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，显色剂底物DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。 　　1.2.2 计算机图像分析 采用高清晰度病理图像分析系统(ImagePro Plus 5.0,美国Media Cyberics公司)，对27例胆脂瘤标本切片和11例外耳道正常皮肤组织标本切片的免疫组织化学染色结果进行定量分析，每张切片均选取不相重叠的5个代表部位，在400倍视野下测量阳性细胞的平均光密度，取其均值为该标本测量结果。 　　1.2.3 光镜观察 标本经10%甲醛固定24～48 h，用乙二胺四乙酸脱钙3～4周，以触之富有弹性、针能轻松刺入为准，常规石蜡包埋，连续切片制成5 μm厚的玻片，常规HE染色后光镜（BX51,日本Olympus公司）下观察。 　　1.2.4 电镜观察 标本修成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm,用2.5%戊二醛固定，4 ℃保存，0.1 mol/L二甲砷酸钠溶液洗涤,1%四氧化锇后固定,酒精逐级脱水,环氧树脂包埋,制成超薄切片,醋酸铀和枸橼酸铅双重染色,透射电镜（日立Hu12A型，日本）下观察。 　　1.3 统计学处理 阳性细胞染色结果以图像分析的光密度值（D，x±s）表示。采用SPSS 13.0软件包进行t检验，Plt;0.05为差别有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 免疫组织化学检测 　　2.1.1 RANKL的阳性表达 RANKL基因蛋白反应物呈棕黄色颗粒，阳性染色主要定位于细胞质和部分细胞膜。在27例胆脂瘤中，有22例可见RANKL的阳性表达，阳性染色细胞主要为胆脂瘤上皮层下的成纤维细胞和淋巴细胞，异物巨细胞和化生的腺体内皮细胞亦可见RANKL的阳性表达。在11例外耳