积雪草酸抑制HSCT6细胞Ⅰ型胶原蛋白表达.docVIP

　　积雪草酸抑制HSCT6细胞Ⅰ型胶原蛋白表达 【摘要】 目的： 研究 外源性TGFβ对肝星状细胞系（HSCT6）的激活作用，以及积雪草酸抑制HSCT6细胞Ⅰ型胶原蛋白合成的药理作用. 方法 ：用LDH和MTT实验测定积雪草酸对HSCT6细胞的细胞毒性和细胞增殖的 影响 . 检测HSCT6细胞受不同剂量和不同时间TGFβ刺激后表达Ⅰ型胶原蛋白的最佳剂量和时间. 以不同剂量的积雪草酸作用于TGFβ活化的HSCT6细胞，提取细胞总蛋白，以A， Cat: 546712）， 黄棕色粉末， 无臭， 味苦. 分子式为C48H78O5， 熔点325℃～330℃，不溶于水，溶于二甲亚砜(DMSO), 储存液浓度20 mmol/L. TGF β1（RD Systems， Cat 240B），储存液浓度10 mg/mL. HSCT6由纽约Mount Sinai医学院 Friedmen教授赠送，维持培养在低糖型DMEM（Invitrogen）培养基中，添加10 g/L青链霉素（Invitrogen）和100 mL/L胎牛血清（Hyclone）. 1×105细胞2.5 mL铺6孔培养板， 50 mL/L CO2, 37℃ 培养24 h，换含2 mL/L胎牛血清DMEM继续培养24 h. TGFβ剂量实验组分别加入0.1, 0.5, 1, 2, 5 ng/mL TGFβ，培养24 h后收取细胞蛋白；TGFβ时间实验中各组均同样加入1 ng/mL TGFβ，分别在0, 6, 1, 24, 48 h收取细胞蛋白；积雪草酸实验分别加积雪草酸 0, 5, 10, 20, 30 μmol/L，2 h后除空白对照孔外，各孔加1 ng/mL TGFβ，24 h后提取细胞蛋白. 　　1.2方法 　　1.2.1乳酸脱氢酶细胞毒性实验（LDH） 　　LDH试剂盒购自SIGMA公司. HSCT6细胞维持培养在100 mL/L胎牛血清、10 g/L青链霉素的DMEM中. 1×105 HSCT6铺96孔板，细胞连续性达70％，吸弃上清，无血清DMEM 200 μL 洗2次. 2 mL/L胎牛血清DMEM中加入积雪草酸或DMSO，浓度分别为2.5, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80 μmol/L，200 μL加入细胞培养孔， 20 g/L Triton100作阳性对照，2 g/L胎牛血清DMEM作阴性对照，每剂量组各为3孔，37℃，50 mL/L CO2培养24 h. 将每孔上清吸出置另一96孔板相应孔，2000 r/min, 5 min待测. 将原各孔中残余液体吸干净，加入含20 g/L Triton100的DMEM 200 μL, 37℃，50 mL/L CO2培养30 min，使细胞裂解，2000 r/min, 5 min. 按试剂盒操作说明检测上清中以及细胞内的LDH，以490 nm波长测定A值，LDH释放率=A上清/(A上清+A细胞内)×100%. 　　1.2.2细胞增殖活性实验（MTT） 　　HSCT6细胞培养方法以及积雪草酸处理浓度和对照组的设置均与LDH检测方法中描述的相同. MTT检测试剂购自Promega公司. 加入MTT染液在37℃培养4 h, 加入溶解液室温过夜，测定A570 nm/A650 nm双波长的吸光度. 　　1.2.3蛋白质提取及定量用RIPA（10 g/L Nonidet P40, 1 g/L SDS, 1 mmol/L PMSF, 5 g/L sodium deoxycholate, 1 mmol/L sodium orthovanadate, 10 mmol/L sodium fluoride in PBS） 　　细胞蛋白裂解液250 μL，将6孔板每孔中的细胞蛋白收集至1.5 mL离心管管中，超声粉碎500 in离心10 min，收取上清. 细胞蛋白浓度测定按照BioRad Laboratories蛋白测定试剂盒（Cat5000113）说明书来操作. 用RIPA裂解液将蛋白调节为一致浓度后，加入等体积的2×SDS上样缓冲液（100 mmol/L Tris·HCl, 40 g/L SDS，200 g/L甘油，2 g/L bromophenol blue）. 100℃蛋白变性5 min备用. 　　1.2.4免疫印记40 mL/L积层胶，100 mL/L分离胶，总蛋白20 μg的样本，加样至100 mL/L SDSPAGE中电泳100 V，90 min. 然后将蛋白转移至PVDF膜，150 V，90 min. 转膜后TBST洗膜. 以50 mL/L脱脂奶粉TBST封闭液室温下封闭60 min；TBST洗膜. 加入适当浓度的一抗孵育，4℃轻摇过夜. TBST洗膜：加入适当浓度