药用植物胡黄连ISSR.docVIP

　　药用植物胡黄连ISSR 作者：刘小莉 普春霞 杨耀文 钱子刚 【摘要】 目的优选胡黄连稳定的ISSR-PCR反应体系。方法采用4因素（dNTPs、Mg2+、Taq酶、引物）4水平的正交实验和单因子梯度优化相结合的方法。结果适于胡黄连的25 μl的ISSR-PCR反应体系中各因素最佳浓度分别为10×buffer2.5 μl,dNTPS150 μmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,Taq酶1U，引物0.5μmol/L,DNA20 ng或10×buffer 2.5 μl,dNTPs150 μmol/L,Mg2+2 mmol/L,Taq酶0.5U，引物0.5 μmol/L,DNA20 ng。结论对于胡黄连ISSR-PCR实验，一次正交实验完全可以建立起满足要求的PCR体系。 【关键词】 胡黄连； 正交实验； 单因子； ISSR-PCR 　ISSR是Zietke,凭证标本保存于云南中医学院中药学院)的胡黄连幼嫩叶片，硅胶干燥后保存于-20℃冰箱中。ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的序列由上海生物工程公司合成。PCR反应相关试剂购自大连宝生物工程有限公司，PCR反应在Biometra PCR仪上进行。 　　 2 方法 　　2.1 基因组DNA提取与检测采用CTAB法，略加改良。1%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，总DNA用无菌双蒸水稀释到10 ng/μl，-20℃冰箱保存。 　　2.2 反应体系正交实验初选本研究 参考 豇豆［16］、玄参［17］、石斛［18］、永瓣藤［19］、黄连［20］的ISSR反应条件，初步确定dNTPs、Taq酶、Mg2+、引物浓度各4个水平。见表1。按照L16（4）正交表形成16个组合的实验方案。见表2。表1 用于胡黄连1SSR-PCR正交实验的4因子4水平，表2 胡黄连ISSR - PCR L16（4）正交实验各组合（略）。 　　2.3 单因子梯度实验本研究在正交实验所初选的PCR反应体系的基础上，对单个因子又设置了一定的梯度，以进一步优化所初选的反应体系，并比较单因子浓度对反应体系的影响。PCR总体积为25 μl，其中dNTPs设置了0.1 ，0.125，0.15，0.175，0.2 mmol/L 5个浓度梯度；Mg2+设置了1，1.25 ，1.5 ，1.75 ，2 mmol/L 5个浓度梯度；Taq DNA酶设置了0.5，0.75，1，1.25，1.5，2 U 6个浓度梯度；引物设置了0.3，0.35，0.4，0.45，0.5 μmol/L 5个浓度梯度；模板设立了10，20，30，40，50，100 ng 6个浓度梯度。 　　2.4 PCR 扩增与产物检测反应通过引物筛选后，选用引物856（序列为5’-3’ ACA CAC ACA CAC ACA CYA）为ISSR-PCR 反应体系优化的引物。反应体系为25 μl,内含10×PCR buffer2.5 μl, DNA20 ng, 其余成分按照表2进行。反应程序: 94℃预变性5min, 94℃变性1 min, 55℃退火1 min , 72℃延伸2 min，循环35次，72℃延伸5 min，4℃保存。PCR产物均在含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中，以0.5×TBE为电泳缓冲液电泳分离，最后用紫外成像系统(Tanon GIS-2009)观察并成像。 　 　3 结果 　　3.1 正交实验结果 　　正交试验结果从图1直观可见，16个组合中除了9号和13号以外，均有扩增产物，但1，2，3，4，7，8，14，15，16号所扩增的条带较弱，无法统计，予以淘汰。5，6，10，11，12号均扩增出了清晰的条带，且条带数较多，但10，11，12号非特异性扩增严重，图谱背景模糊，亦予以淘汰。5，6号扩增条带相似，均为6条亮度适中、分离较好的条带。综上所述，本研究确定5号和6号为最理想的反应体系。 　　3.2 Taq单因子浓度梯度下扩增产物比较在对dNTPs、Mg2+、引物、Tag酶、模板5个因子进行了梯度对比后发现，各个因子的浓度均在较大的范围内对扩增产物不造成显著影响。dNTPs是PCR的原料，浓度太高容易产生错误掺入，浓度太低产率太低，常用的是0.05～0.2 mmol/L［21］。本实验发现胡黄连PCR扩增中100～300 mmol/L的dNTPs均产生了一致的扩增条带。Mg2+在1～2 mmol/L浓度内均扩增出了6条带，只是在低浓度（1～1.5 mmol/L）下扩增谱带的清晰度较之高浓度（1.75和2 mmol/L）条件下略差。引物的浓度会影响PCR扩增的特异性,在胡黄连的ISSR-PCR扩增中引物浓度在5个浓度下（0.3～0.5 μmol/L）的扩增谱带无显著差异。对大多数物种来说Taq酶浓度变化对试验结果影响较大